李玲，李俊杰，王俊英，黃沛玲

華僑大學化工學院，廈門 361021

隨著化工制造業(yè)的迅速發(fā)展，很多手性農藥正在不斷開發(fā)。目前在中國，超過40%的農藥是手性的，預計這一比例還會增加[1]。但是目前手性農藥對映體的分離和制備難度比普通化合物要高得多，因此大部分手性農藥仍以外消旋體形式生產、銷售和使用。而大量研究結果表明，當手性農藥的對映體進入生物體內時，由于生物體對各手性異構體識別能力的差異，以及不同靶標位點對各異構體的匹配性不同，使得異構體之間在生物活性、環(huán)境行為和毒理學等方面均可能存在差異[2]。因此，從對映體層面研究手性農藥的環(huán)境行為及生態(tài)效應具有重要意義。

水胺硫磷(isocarbophos, ICP)是一種高效廣譜的有機磷殺蟲劑，對螨類及鱗翅目、半翅目害蟲具有良好的防治效果。ICP具有一個磷手性中心，結構式如圖1所示。Lin等[2]研究(+)-ICP和(-)-ICP對大型蚤的48 h-LC50相差近50倍。Lu等[3]通過測定藻類生長抑制率、葉綠素含量、總可溶性蛋白質和超氧陰離子自由基含量，發(fā)現(xiàn)ICP對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)在劑量-效應關系上具有對映體選擇性毒性。Liu等[4]以HepG2細胞作為體外模型，研究發(fā)現(xiàn)，(-)-ICP對肝細胞的毒性比(+)-ICP高2倍；還發(fā)現(xiàn)(-)-ICP上調Bax蛋白表達和下調Bcl-2的表達水平，導致Bax/Bcl-2比值增加，繼而導致細胞活力降低和細胞凋亡。朱欣凱[5]研究發(fā)現(xiàn)，(+)-ICP和(-)-ICP對東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)的LD50分別為0.609 mg·kg-1(蟲體質量)和79.412 mg·kg-1(蟲體質量)，相差130倍。由此可見，ICP對水生生物可能會產生對映體選擇性毒理效應。因此，從對映體層面來研究手性農藥ICP的環(huán)境行為及生態(tài)效應具有重要意義。

水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產者藻類對毒物比較敏感，大型蚤是被國際公認的標準毒性試驗生物。本課題選擇浮游植物水華微囊藻(Microcystisflos-aquae)和浮游動物大型蚤(Daphniamagna)作為受試生物，研究ICP對不同營養(yǎng)級浮游生物抗氧化酶毒性的對映體選擇性差異，為全面評估手性有機磷農藥殘留對生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)毒理效應提供科學依據，同時也為有機磷農藥的合理利用與污染防治提供理論支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試溶劑及儀器

ICP，純度為99.5%，北京壇墨質檢科技有限公司。ICP的2個對映體由實驗室自制，兩者純度≥98.0%。丙酮、正己烷、異丙醇和乙醇均為色譜純，購于國藥集團化學試劑有限公司。80%磷酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250等，均為分析純，購于阿拉丁公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)測定試劑盒和丙二醛(malondialdehyde, MDA)測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。

高效液相色譜(日本島津，LC-10AVP)，氣相色譜(中國精科捷，GC-9160)，Chiralcel OD-H柱(上海大賽璐藥物手性技術有限公司)，浮游植物分類熒光儀(德國Walz，Phyto-PAM)。

1.2 ICP對映體的制備和定量

用HPLC法對ICP進行拆分與制備。色譜條件：流動相為80∶20(V∶V)的正己烷/異丙醇，大賽璐手性柱Chiralcel OD-H，流速為0.8 mL·min-1，紫外檢測波長230 nm，室溫，進樣量為每次20 μL。在此條件下，ICP對映異構體的出峰順序先后為(+)-ICP、(-)-ICP[2]。人工手動在檢測器出口處收集液體，并在室溫下旋蒸濃縮。

利用氣相色譜對ICP的2個對映體樣品進行定量。色譜條件：HP-5石英毛細管柱；氮載氣流速為1.0 mL·min-1，進樣口溫度為250 ℃，升溫程序為柱溫箱初始溫度180 ℃，保持2 min，然后20 ℃·min-1升溫到280 ℃，保持10 min，NP檢測器溫度是300 ℃，在不分流模式下對映體樣品的進樣量為1 μL。

1.3 實驗生物的培養(yǎng)及染毒

1.3.1 水華微囊藻的培養(yǎng)及染毒

浮游植物水華微囊藻由中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫提供。按照藻類生長抑制試驗的標準方法(GB/T 31270)，采用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)。

當水華微囊藻進入對數生長期之后，并調節(jié)初始接種藻密度為5×106mL-1，用ICP及其對映體進行染毒。濃度設置為10-4、10-3、10-2、10-1和1 mg·L-1，并設置溶劑對照(0.03%丙酮)，每組設置4個平行。每天搖動3～4次，保持藻類懸浮生長。

1.3.2 大型蚤的培養(yǎng)及染毒

浮游動物大型蚤，購于中國科學院武漢水生生物研究所。大型蚤的培養(yǎng)液按照OECD規(guī)定[6]進行培養(yǎng)。大型蚤敏感性試驗采用國際標準《水質-大型蚤運動抑制的測定》(ISO 6341:1996)[7]進行。

不同日齡的蚤體內抗氧化酶活性不同，本文選擇4日齡的蚤染毒進行實驗[8-9]，每個濃度實驗蚤60只，染毒溶液2 L，每組設置3個平行。根據Lin等[2]研究中所得出的ICP及其對映體對大型蚤的48 h-LC50，按(-)-ICP LC50值的1/353～1/18的比例設置染毒溶液濃度梯度，分別為1、2.5、5、10和20 μg·L-1，并設置溶劑對照(0.03%丙酮)。染毒48 h后進行氧化損傷指標測定。

1.4 葉綠素a含量的測定

水華微囊藻染毒10 d后，取1 mL藻液置于樣品杯中，在浮游植物分類熒光儀的32 μmol·(m2·s)-1光強下測定葉綠素a含量[10]。實驗重復3次。

1.5 酶源的制備

對水華微囊藻染毒96 h后，每瓶取80 mL藻液，在4 ℃條件下5 000 r·min-1冷凍離心15 min，去除上清液，用磷酸緩沖液沖洗，并于冰浴中超聲破碎15 min(工作3 s，間隔3 s)。

對大型蚤染毒48 h后，取50只蚤，吸干表面水分，放入離心管中，加入Tris-HCl緩沖液置于冰浴中超聲破碎5 min(工作3 s，間隔3 s)。

水華微囊藻和大型蚤在破碎完全后，于4 ℃條件下12 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液，即為粗酶液樣品。-80 ℃超低溫保存待用。

1.6 蛋白含量及氧化損傷相關指標的測定

蛋白質含量采用考馬斯亮藍比色法測定[11]；SOD、CAT活性及MDA含量均根據南京建成生物公司的試劑盒進行測定。實驗均重復3次。

1.7 顯著性檢驗

用Office excel和Origin 8.5進行數據的圖表分析，用SPSS16.0軟件進行相關顯著性分析。

2 結果(Results)

2.1 ICP對映體的拆分

ICP液相色譜拆分條件為：流動相正己烷/異丙醇80∶20，流速0.8 mL·min-1，柱壓為5.0 MPa。ICP這2個對映體的保留時間分別為8.5 min和13.2 min，達到基線分離，對映體分離色譜圖如圖2所示。

圖2 ICP對映體手性拆分的典型圖譜Fig. 2 Chiral separation chromatogram of ICP enantiomers

2.2 ICP對浮游植物水華微囊藻葉綠素a含量的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對水華微囊藻葉綠素a含量的影響如圖3所示，水華微囊藻在(+)-ICP脅迫下，10-4mg·L-1濃度組的葉綠素a含量均顯著高于對照組(P<0.05)，而10-2～1 mg·L-1濃度組的葉綠素a含量均顯著低于對照組(P<0.05)。在(-)-ICP脅迫下，10-4～10-1mg·L-1濃度組的葉綠素a含量均顯著高于對照組(P<0.05)，而1 mg·L-1的(-)-ICP的葉綠素a含量與對照組相比則無顯著性差異(P>0.05)。在ICP外消旋體(rac-ICP)脅迫下，10-3～10-2mg·L-1濃度組的葉綠素a含量均顯著高于對照組(P<0.05)，1 mg·L-1rac-ICP濃度組的葉綠素a含量顯著低于對照組(P<0.05)。由以上結果可知，(+)-ICP和(-)-ICP對水華微囊藻葉綠素a含量影響存在對映體選擇性差異。

圖3 ICP及其對映體對水華微囊藻葉綠素a含量的影響注：rac-ICP表示ICP的外消旋體；相鄰條上不同的小寫字母表示相同 濃度不同對映體之間存在顯著差異；相同填充圖案上 不同的大寫字母表示相同對映體不同濃度之間存在顯著差異； *表示與對照組相比有顯著差異；P<0.05，n=3；下同。Fig. 3 Effect of ICP and enantiomers on chlorophyll a of Microcystis flos-aquaeNote: rac-ICP stands for the racemate of ICP; different small letters above adjacent bars indicate significant differences between different enantiomers; different capital letters on the same pattern indicate significant differences between different concentrations of the same enantiomer; *indicates a significant difference compared with control; P<0.05, n=3; the same as follow.

2.3 ICP對浮游植物水華微囊藻氧化損傷的對映體選擇性影響

2.3.1 ICP對水華微囊藻SOD活性的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對水華微囊藻SOD活性的影響如圖4所示，水華微囊藻在(+)-ICP脅迫下，10-3～1 mg·L-1濃度組的SOD活性均顯著低于對照組(P<0.05)，與對照組相比分別下降了15.4%、31.2%、25.7%和22.4%；而10-4mg·L-1濃度組的SOD活性與對照組無顯著差異(P>0.05)。在(-)-ICP脅迫下，各濃度組的SOD活性與對照組均無顯著性差異(P>0.05)。在rac-ICP脅迫下，其SOD活性隨著rac-ICP濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，其中，低濃度組(10-4和10-3mg·L-1)的SOD的活性與對照組相比都上升了10.0%(P<0.05)；高濃度組(≥10-2mg·L-1)的SOD活性均顯著小于對照組(P<0.05)，且1 mg·L-1濃度組的SOD活性與對照組相比下降了38.0%。由以上結果可知，(+)-ICP和(-)-ICP對水華微囊藻SOD活性影響存在對映體選擇性差異。

圖4 ICP及其對映體對水華微囊藻超氧化物 歧化酶(SOD)活性的影響Fig. 4 Effect of ICP and its enantiomers on superoxide dismutase (SOD) activity of Microcystis flos-aquae

2.3.2 ICP對水華微囊藻CAT活性的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對水華微囊藻CAT活性的影響如圖5所示，在(+)-ICP脅迫下，各濃度組的CAT活性隨著(+)-ICP濃度的增加而逐漸降低，且呈現(xiàn)劑量效應關系。10-4～10-1mg·L-1濃度組的CAT酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，與對照組相比分別上升了70.0%、40.0%、20.0%和10.0%；而1 mg·L-1濃度組的CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)。在(-)-ICP脅迫下，水華微囊藻的CAT活性變化隨著(-)-ICP濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。10-4～10-3mg·L-1濃度組的CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)；10-2～1 mg·L-1濃度組的CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)。在rac-ICP的脅迫下，除了10-3mg·L-1濃度組的CAT活性與對照組無顯著性差異(P>0.05)，其余濃度組的CAT活性均顯著低于對照組(P<0.05)，與對照組相比分別下降了28.8%、33.3%、25.1%和16.6%。由此可見，(+)-ICP和(-)-ICP對水華微囊藻CAT活性影響存在對映體選擇性差異。

圖5 ICP及其對映體對水華微囊藻 過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 5 Effect of ICP and its enantiomers on catalase (CAT) activity of Microcystis flos-aquae

2.3.3 ICP對水華微囊藻MDA含量的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對水華微囊藻MDA含量的影響如圖6所示，在(+)-ICP脅迫下，除了10-3mg·L-1濃度組的MDA含量與對照組無顯著差異(P>0.05)，其他濃度組的MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05)，且與對照組相比分別下降了23.0%、26.8%、26.8%和9.2%。在(-)-ICP脅迫下，除了10-3mg·L-1濃度組的MDA含量與對照組無顯著差異(P>0.05)，其余濃度組的MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05)，且與對照組相比分別下降了29.0%、23.1%、16.4%和10.4%。在rac-ICP的脅迫下，各濃度組的MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05)，且與對照組相比分別下降了28.2%、13.7%、43.8%、44.1%和38.8%。由此可見，(+)-ICP和(-)-ICP對水華微囊藻MDA含量的對映體選擇性影響不明顯。

圖6 ICP及其對映體對水華微囊藻 丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 6 Effect of ICP and its enantiomers on malondialdehyde (MDA) content of Microcystis flos-aquae

2.4 ICP對浮游動物大型蚤氧化損傷的對映體選擇性影響

2.4.1 ICP對大型蚤SOD活性的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對大型蚤體內SOD活性的影響如圖7所示，在(+)-ICP脅迫下，5 μg·L-1濃度組的SOD活性與對照組相比下降了17.0%(P<0.05)；而10 μg·L-1和20 μg·L-1濃度組的SOD活性與對照組無顯著差異(P>0.05)。在(-)-ICP脅迫下，各濃度組大型蚤體內的SOD活性均顯著高于對照組(P<0.05)，且(-)-ICP濃度越高，SOD的活性越大；其中10 μg·L-1和20 μg·L-1濃度組的SOD活性與對照組相比分別上升了68.0%和79.0%。在rac-ICP脅迫下，5 μg·L-1濃度組的SOD活性與對照組無顯著差異(P>0.05)；10 μg·L-1和20 μg·L-1濃度組的SOD活性與對照組相比分別增加了16.0%和24.0%。由此可見，(+)-ICP和(-)-ICP對大型蚤SOD活性的影響存在對映體選擇性差異。

圖7 不同濃度ICP及其對映體對大型 蚤體內SOD活性的影響Fig. 7 Effects of ICP and its enantiomers on SOD activity in Daphnia magna

2.4.2 ICP對大型蚤CAT活性的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對大型蚤體內CAT活性的影響如圖8所示，在(+)-ICP脅迫下，除1 μg·L-1和20 μg·L-1濃度組的CAT活性與對照組相比分別下降了19.7%和15.2%，其余濃度組CAT活性均顯著高于對照組(P<0.05)，且2.5 μg·L-1和5 μg·L-1濃度組的CAT活性與對照組相比分別上升了14.0%和12.0%。在(-)-ICP脅迫下，各濃度組CAT活性均顯著低于對照組(P<0.05)，且活性下降范圍是17.2%～40.9%。在rac-ICP脅迫下，各濃度組CAT活性均顯著低于對照組(P<0.05)，且活性下降范圍是5.5%～17.8%。由此可見，ICP對大型蚤CAT活性的影響存在對映體選擇性差異。

圖8 不同濃度ICP及其對映體對大型 蚤體內CAT活性的影響Fig. 8 Effects of ICP and its enantiomers on CAT activity in Daphnia magna

2.4.3 ICP對大型蚤MDA含量的對映體選擇性影響

ICP及其對映體對大型蚤體內MDA含量的影響如圖9所示，在(+)-ICP脅迫下，各濃度組的MDA含量隨著(+)-ICP濃度增加而上升；除了1 μg·L-1濃度組的MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，其余濃度組均顯著高于對照組(P<0.05)，且5、10和 20 μg·L-1濃度組的MDA含量與對照組相比分別上升了23.0%、52.0%和139.0%。在(-)-ICP脅迫下，各濃度組大型蚤體內的MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05)，在1～5 μg·L-1時，大型蚤體內MDA含量隨濃度增加而上升，而在5～20 μg·L-1時，MDA含量隨濃度增加而下降(P<0.05)。在5 μg·L-1濃度時，雖然大型蚤體內MDA含量最高，但是與對照組相比也下降了8.0%。在rac-ICP脅迫下，1～5 μg·L-1濃度組的MDA含量與對照組無顯著性差異(P>0.05)；而10 μg·L-1和20 μg·L-1濃度組的MDA含量與對照組相比分別下降了7.4%和17.5%。由此可見，ICP對大型蚤MDA含量的影響存在顯著的對映體選擇性差異。

圖9 不同濃度ICP及其對映體對大型 蚤體內MDA含量的影響Fig. 9 Effects of ICP and its enantiomers on MDA content in Daphnia magna

3 討論(Discussion)

葉綠素a是衡量植物生長狀況的重要指標之一，其含量可以反映浮游植物的存活情況[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于(+)-ICP，最低濃度10-4mg·L-1濃度組對葉綠素a含量均表現(xiàn)為促進作用，而10-2～1 mg·L-1濃度組對葉綠素a含量均表現(xiàn)為抑制作用；而對于(-)-ICP，除了最高濃度1 mg·L-1，其余濃度組對水華微囊藻的葉綠素a含量均表現(xiàn)為促進作用。這個結果說明ICP這2個對映體在一定的濃度范圍對水華微囊藻的葉綠素a含量表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，稱為Hormesis效應[13]。低促現(xiàn)象的出現(xiàn)一方面可能是因為低濃度的ICP啟動了水華微囊藻機體內修復系統(tǒng)功能及過量修復；而另一方面也可能是因為水華微囊藻利用了ICP中的P元素作為其營養(yǎng)源，提高了葉綠素a的含量，從而促進了藻類生長[14]。然而，隨著ICP對映體濃度的增加，可能抑制了水華微囊藻光合色素的合成，從而對水華微囊藻產生的綜合效應逐漸從促進轉變?yōu)橐种啤１緦嶒灲Y果與Lu等[15]對ICP脅迫斜生柵藻藻密度的研究結果基本一致。Smythers等[16]研究發(fā)現(xiàn)，小球藻暴露在除草劑拿捕凈后，光合色素合成酶活性受到抑制，導致葉綠素a含量降低。此外，從水華微囊藻出現(xiàn)抑制作用時的ICP及其對映體濃度也可以推出它們的毒性大小順序為：(+)-ICP>rac-ICP>(-)-ICP。這與Lin等[2]研究中ICP及其對映體對大型蚤的48 h急性毒性大小順序一致。

同樣的，浮游動物大型蚤在受到(-)-ICP和rac-ICP的輕微脅迫時，通過誘導自身的SOD酶來增強抗氧化能力。而毒性較大的(+)-ICP對大型蚤的脅迫可能已經過了SOD的誘導期，而CAT活性的增加從側面印證了這種推測，因為前期SOD的大量消耗產生了大量的H2O2，從而誘導了CAT活性的增加[25]。Hu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，氯菊酯的2個對映體1R-tris-PM和1S-cis-PM誘導了PC12細胞的CAT酶而抑制了SOD酶。另外，ICP及其對映體處理組中大型蚤MDA含量變化說明了(+)-ICP濃度的增加會對大型蚤造成更大程度的脂質過氧化作用，而相同濃度的(-)-ICP和rac-ICP處理組的MDA含量未高于空白組，結合SOD活性和CAT活性的結果，可知(-)-ICP和rac-ICP處理組并未引起大型蚤的氧化損傷，而MDA含量減少可能是因為脂質過氧化作用減弱。Li等[27]發(fā)現(xiàn)三氯殺蟲酯中毒性更大的S-(+)-AF會導致PC12細胞中SOD活性降低，而MDA含量上升。

因此，ICP對浮游生物的氧化損傷存在對映體選擇性差異，且對于浮游植物和浮游動物，毒性順序都表現(xiàn)為(+)-ICP>(-)-ICP。除了浮游植物和浮游動物，Di等[28]研究發(fā)現(xiàn)，對于4種陸生生物ICP的2個對映體的毒性指向性與本文一致，且(+)-ICP和(-)-ICP的毒性相差232倍。除了ICP之外，很多文獻也都發(fā)現(xiàn)其他手性化合物會引起氧化損傷的對映體選擇性差異。Hu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，氯菊酯脅迫下，1R-cis-PM和1S-cis-PM誘導了PC12細胞的CAT活性上升而使SOD活性顯著下降。Li等[27]發(fā)現(xiàn)三氯殺蟲酯的S-(+)-AF使得PC12細胞的SOD和CAT活性降低，MDA水平升高。Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，(+)-已唑醇對斜生柵藻SOD活性產生的脅迫壓力大于(-)-已唑醇；而在誘導CAT酶活性上，(-)-已唑醇大于(+)-已唑醇。

綜上所述，手性農藥在使用過程中，除了高效對映體對靶標生物有明顯作用之外，其他無效或低效的對映體也會對非靶標生物造成不同程度的傷害。而本文研究的ICP對映體通過液相色譜進行拆分，對于水華微囊藻的葉綠素a、水華微囊藻和大型蚤的氧化損傷指標SOD活性、CAT活性和MDA含量毒性影響大小均為(+)-ICP>(-)-ICP，且在ICP濃度≥10-4mg·L-1時，對水華微囊藻的葉綠素a和氧化損傷就有明顯的對映體選擇性差異；在ICP濃度≥1 μg·L-1時，對大型蚤的氧化損傷就有明顯的對映體選擇性差異。此項研究結果為手性農藥的環(huán)境生態(tài)風險評價提供科學依據。