李榮芳，金 龍，趙立丹

(西安市第九醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710054)

骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)是造血干細(xì)胞惡性疾病，早期主要表現(xiàn)為骨髓造血干細(xì)胞凋亡、分化成熟障礙等，中期主要表現(xiàn)為惡性克隆性原始細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，呈現(xiàn)向急性白血病轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)[1]。該病常見于老年人群，發(fā)病相對(duì)隱匿，常導(dǎo)致臨床漏診及誤診，增加急性白血病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。另外， MDS患者中約90%在確診時(shí)骨髓呈現(xiàn)增生性活躍狀態(tài)，伴隨外周血細(xì)胞水平降低，此為無效造血，可嚴(yán)重危及患者生命健康[4]。MDS的診斷與治療一直是國(guó)內(nèi)外血液病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但目前仍缺乏靈敏度高、特異性好的分子標(biāo)志物或檢測(cè)手段來識(shí)別惡性克隆。研究[5]證實(shí)，MDS發(fā)病機(jī)制包括：造血干細(xì)胞分子遺傳變異，產(chǎn)生異常前體細(xì)胞[6]；體內(nèi)細(xì)胞免疫等免疫監(jiān)視失能，異常克隆免疫逃逸/耐受。部分研究[7]發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3)在MDS造血干細(xì)胞上過度表達(dá)。李雯雯等[8]則指出，MDS患者血清乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)與疾病的進(jìn)展與預(yù)后相關(guān)，監(jiān)測(cè)該類指標(biāo)對(duì)于患者的診治具有一定的提示性。雖然TIM-3在血液疾病等方面研究報(bào)道較多，但不同研究間存在一定的差異性[9]。本研究對(duì)MDS患者外周血TIM-3和LDH表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以分析二者在MDS診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安市第九醫(yī)院老年病科2020年1月至2021年1月收治的98例MDS患者作為MDS組，其中男性52例，女性46例；年齡35～64歲，平均(56.36±7.23)歲；體重48～61 kg，平均(55.36±5.15)kg；依據(jù)MDS國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)[10]，低危41例，中危35例，高危22例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，排除其他造血及非造血系統(tǒng)疾?。虎跓o認(rèn)知、精神障礙；③配合度較高。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、肝、腎等臟器功能障礙；②合并免疫系統(tǒng)疾患；③患有其他惡性腫瘤。選取同期36名健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性19例，女性17例；年齡36～65歲，平均(57.00±7.47)歲；體重45～61 kg，平均(55.82±5.41)kg。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。數(shù)據(jù)均選自本院一批次驗(yàn)證測(cè)試的驗(yàn)證計(jì)劃。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 外周血單核細(xì)胞(PBMC)表面TIM-3表達(dá)水平檢測(cè)：對(duì)照組于體檢當(dāng)日、MDS組于入院第1天采集空腹靜脈血4 ml，EDTA抗凝，每管加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光反應(yīng)5 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次，離心棄上清后PBS重懸備用。取制備好的PMBC懸液100 μl，將每例樣本分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組(空白對(duì)照組不加任何試劑，陰性對(duì)照組只加各類抗體，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組加PBMC懸液和各類抗體)，分別吸取熒光標(biāo)記的抗體(CD4、TIM-1、TIM-3抗體)各5 μl加入流式管混勻，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌1次，離心棄上清后加入200 μl PBS重懸液，采用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)TIM-3表達(dá)水平。TIM-3試劑盒(批號(hào)：F02731；規(guī)格：96 T)購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.2 LDH表達(dá)水平檢測(cè)：對(duì)照組于體檢當(dāng)日、MDS組于入院第1天采集空腹靜脈血3 ml，EDTA抗凝，于2 h內(nèi)送至檢驗(yàn)科，3500 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min，分離血清后取0.5 ml分裝于EP管內(nèi)，于冰箱-80 ℃保存待測(cè)。選用日立760全自動(dòng)生化儀，采用速率法對(duì)LDH水平進(jìn)行測(cè)定。LDH正常參考值為218～458 U/L。

2 結(jié) 果

2.1 兩組TIM-3和LDH表達(dá)水平比較 見表1。與對(duì)照組相比，MDS組TIM-3和LDH表達(dá)水平更高(均P<0.05)。

表1 兩組TIM-3和LDH表達(dá)水平比較

2.2 不同預(yù)后分級(jí)MDS患者TIM-3和LDH表達(dá)水平比較 見表2。不同預(yù)后分級(jí)MDS患者TIM-3和LDH表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 不同預(yù)后分級(jí)MDS患者TIM-3和LDH表達(dá)水平比較

2.3 TIM-3、LDH單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷MDS效能分析 見表3(圖1)。TIM-3單項(xiàng)診斷MDS的敏感性與特異性分別為70.10%、69.40%，LDH則為62.89%、77.80%。TIM-3、LDH聯(lián)合檢測(cè)診斷MDS的敏感性與特異性分別為88.70%和68.12%，二者聯(lián)合檢測(cè)診斷價(jià)值高于單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

表3 TIM-3、LDH單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷MDS效能分析

圖1 TIM-3、LDH單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷MDS ROC曲線

3 討 論

MDS以無效造血和易轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病為特點(diǎn)[12-14]。TIM-3屬于免疫球蛋白TIM家族，小鼠中TIM家族包括TIM-1至TIM-8，而在人類基因中只鑒定出TIM-1/3/4。TIM-3基因定位于人類染色體5q33.2，其功能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[15]。隨著研究的深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)TIM-3還可以表達(dá)在自然殺傷細(xì)胞(NK)、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞亞群上，并且對(duì)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌起著重要調(diào)節(jié)作用，在病毒性感染、自身免疫病、腫瘤免疫逃逸、移植免疫耐受中均發(fā)揮重要作用。諸多研究[16-17]指出，TIM-3在腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，且這種高表達(dá)多與腫瘤密切相關(guān)。當(dāng)TIM-3調(diào)節(jié)固有免疫反應(yīng)時(shí)，并不直接作用于半乳糖凝集素9(Gal9)，而是通過與高遷移率族蛋白 B1結(jié)合而引起后續(xù)免疫應(yīng)答[18]。此外，TIM-3還可與主要作用于凋亡細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸配體相結(jié)合，在消除體內(nèi)凋亡細(xì)胞和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮作用。LDH參與機(jī)體糖、脂、蛋白等多種重要物質(zhì)代謝[19]，其廣泛存在于人體心、腎、骨骼肌等中，正常人血清中含量極少[20]。LDH水平在血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤如MDS、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、噬血細(xì)胞綜合征、淋巴瘤等中均有不同程度升高[21]。本研究中，與對(duì)照組相比，MDS組TIM-3和LDH表達(dá)水平明顯更高，提示MDS患者TIM-3和LDH表達(dá)水平出現(xiàn)了異常。MDS此類疾患的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)為細(xì)胞基因突變發(fā)生率甚高，由之產(chǎn)生的能量代謝障礙及細(xì)胞損傷可能是導(dǎo)致該類患者體內(nèi)LDH升高的原因。MDS患者通常伴有貧血，腫瘤壞死及炎癥因子的釋放等易使細(xì)胞處于缺氧環(huán)境下，無氧酵解加重代謝產(chǎn)物蓄積與代謝紊亂，也可能導(dǎo)致LDH加速釋放入血。在絕大多數(shù)血液疾病的異常造血干細(xì)胞上，TIM-3均高表達(dá)，提示TIM-3可能是急性髓系白血病造血干細(xì)胞的標(biāo)志物。

同時(shí)，本研究還探究了TIM-3和LDH在MDS疾病中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)TIM-3、LDH聯(lián)合檢測(cè)診斷MDS的敏感性與特異性分別為83.67%和91.67%，診斷效能均顯著高于TIM-3、LDH單項(xiàng)檢測(cè)。由此我們可以認(rèn)為，MDS患者體內(nèi)TIM-3、LDH表達(dá)水平均升高，二者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高M(jìn)DS的臨床診斷效能。馮愛梅等[22]認(rèn)為，LDH具有維持其腫瘤、白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的作用?？紤]到白血病、巨幼細(xì)胞性貧血以及MDS患者均會(huì)出現(xiàn)LDH水平升高的現(xiàn)象，故僅將LDH作為MDS的診斷參考指標(biāo)存在一定局限性，易造成漏診或者誤診的情況出現(xiàn)。生理?xiàng)l件下，造血微環(huán)境中分泌的細(xì)胞因子、趨化因子等，以及其中的細(xì)胞成分包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞可通過與造血干、祖細(xì)胞之間的交流而維持正常造血，而疾病狀態(tài)下微環(huán)境中失調(diào)的炎癥因子可擾亂造血干細(xì)胞正常功能，有利于腫瘤細(xì)胞的異常累積[23]。人體內(nèi)的TIM-3可以調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答，降低M1型巨噬細(xì)胞極化，減輕M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)TIM-3的特異性配體Gal9對(duì)促炎或趨化因子等也均有抑制作用[24]，故TIM-3表達(dá)水平一定程度上可以反映MDS疾病的嚴(yán)重程度。TIM-3與LDH聯(lián)合檢測(cè)可以彌補(bǔ)LDH等血液常規(guī)指標(biāo)在疾病診斷中的不足之處，進(jìn)而幫助臨床醫(yī)師準(zhǔn)確對(duì)患者進(jìn)行診治。本研究中，不同預(yù)后分級(jí)患者的TIM-3和LDH表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與研究納入樣本量較少有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MDS患者外周血TIM-3和LDH表達(dá)水平異常升高，二者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高對(duì)MDS疾病的診斷準(zhǔn)確率，方便醫(yī)師后續(xù)治療計(jì)劃與方案的擬定與實(shí)施。