韓金怡，蘇志勇

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)赤峰學(xué)院培養(yǎng)基地，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

近年來(lái)臨床采用以手術(shù)為中心，以放化療、內(nèi)分泌治療為輔助的綜合治療模式顯著降低了乳腺癌復(fù)發(fā)和病死率，但有一部分患者化療獲益甚少，在予以相同臨床干預(yù)情況下，后期疾病轉(zhuǎn)歸大不相同，醫(yī)生對(duì)化療獲益程度及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的判斷缺乏客觀指標(biāo)支持，因此乳腺癌尤其是早期乳腺癌患者術(shù)后管理及治療決策一直是臨床爭(zhēng)議的焦點(diǎn)，準(zhǔn)確對(duì)其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估有重要意義[1-2]?；诖吮尘?，乳腺癌21基因檢測(cè)應(yīng)運(yùn)而生。相關(guān)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，21個(gè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)量和乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該21個(gè)基因由6組基因組合而成。Luminal A型是乳腺癌患者常見(jiàn)的分子分型，研究[5]發(fā)現(xiàn)有脈管轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是Luminal A型乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，但利用21基因檢測(cè)評(píng)估乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)影響因素的研究甚少。本研究主要分析乳腺癌21基因檢測(cè)對(duì)早期Luminal A型乳腺癌治療的指導(dǎo)作用及其相關(guān)因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年12月內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受相關(guān)診治的雌激素受體(ER)和(或)孕激素受體(PR)陽(yáng)性、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)陰性、經(jīng)病理認(rèn)定腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的早期Luminal A型乳腺癌患者174例，均為女性，年齡18～70歲，平均(44.19±4.57)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)確診為非特殊型浸潤(rùn)性乳腺癌[6]；②ER/PR(+)，HER-2(-)或HER-2(+)或HER-2()，如果為HER-2()，則需經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)且結(jié)果為陰性；③腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移經(jīng)病理檢測(cè)為陰性；④血常規(guī)、肝腎功能無(wú)明顯異常；⑤患者及家屬同意行21基因檢測(cè)并得出復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)(RS)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①全身檢查如磁共振、超聲、CT及PET/CT等發(fā)現(xiàn)有其他臟器轉(zhuǎn)移者；②對(duì)內(nèi)分泌治療有禁忌證或在化療前經(jīng)相關(guān)檢查有化療禁忌證者；③處于育齡期患者，經(jīng)血清妊娠試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，或正在哺乳期者；④有嚴(yán)重內(nèi)臟器質(zhì)性病變或體力狀況評(píng)分在1分以上、臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院相關(guān)倫理委員會(huì)書(shū)面同意，且患者或家屬均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色：采用組織芯片制作機(jī)細(xì)針打孔方法從患者組織蠟塊(稱(chēng)為供體蠟塊)中采集數(shù)十至上百圓柱形小組織(組織芯)，并將組織芯整齊排列到另一空白蠟塊(受體蠟塊)中，隨即制成組織芯片蠟塊。對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行切片后轉(zhuǎn)移到載玻片上制成組織芯片。將采集到的組織芯片制成4 μm連續(xù)切片，以二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，切片后經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波抗原修復(fù)，以3% H2O2及非免疫血清分別滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性與非特異性結(jié)合位點(diǎn)，再與一抗ER、PR、HER-2及Ki67于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。第2天切片經(jīng)PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗做陰性對(duì)照，以排除二抗非特異性結(jié)合。

1.2.2 21基因檢測(cè)：采用羅氏Roche 480熒光定量PCR(RT-PCR)儀進(jìn)行21基因檢測(cè)。由廣州閱微醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所(以下簡(jiǎn)稱(chēng)檢驗(yàn)所)與赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院簽訂外送協(xié)議，檢驗(yàn)所將21基因檢測(cè)結(jié)果與美國(guó)Oncotype Dx?試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果應(yīng)完全一致，以液相芯片技術(shù)替代傳統(tǒng)RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)所有患者乳腺癌組織石蠟切片21基因在腫瘤組織中的表達(dá)情況。將檢測(cè)結(jié)果量化為RS。RS=20×(RSu-6.7)，其中Rsu為未校正的RS評(píng)分。RS范圍0～100分，數(shù)值越大，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高，越能從化療中獲益。RS<18分確定為低度復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，18分≤RS<31分確定為中度復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，RS≥31分確定為高度復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[7]。在本研究中，預(yù)先設(shè)定RS<18分為低風(fēng)險(xiǎn)組，RS≥18分為中高風(fēng)險(xiǎn)組。

1.2.3 治療方案選擇與評(píng)估：對(duì)患者進(jìn)行術(shù)前病情評(píng)估，術(shù)后標(biāo)本經(jīng)組織芯片制備及免疫組織化學(xué)染色得出患者免疫組化結(jié)果及TNM分期，依據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[8]分為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組及高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組，均由內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科科室根據(jù)指南討論后制定治療方案，對(duì)低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組[進(jìn)行單純內(nèi)分泌治療(H方案)]和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組[進(jìn)行化療序貫內(nèi)分泌治療(CH方案)]。兩組患者均在其同意下進(jìn)行21基因檢測(cè)并得出RS，再根據(jù)RS制定方案，當(dāng)RS<18分時(shí)(低風(fēng)險(xiǎn)組)可單純進(jìn)行H方案治療，當(dāng)RS≥18分時(shí)(中/高風(fēng)險(xiǎn)組)可進(jìn)行CH方案治療。利用傳統(tǒng)TNM分期結(jié)合NCCN指南制定兩組患者的不同治療方法，分別與21基因檢測(cè)所得出的RS及不同分組治療意見(jiàn)進(jìn)行對(duì)比，總結(jié)兩組患者經(jīng)不同檢測(cè)方法制定的治療方法間的差異，進(jìn)而得出目前應(yīng)用21基因檢測(cè)所帶來(lái)相應(yīng)治療方案選擇上的精準(zhǔn)度。

1.2.4 患者隨訪：對(duì)所有患者隨訪至2019年12月，中位隨訪時(shí)間36個(gè)月。隨訪方式為患者出院后定期復(fù)查結(jié)果、電話(huà)隨訪，21基因檢測(cè)前及檢測(cè)后所有患者均未出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)位臟器轉(zhuǎn)移情況。

1.2.5 資料收集：收集所有患者臨床資料，包括年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、病理組織學(xué)分級(jí)、脈管癌栓、Ki67等，分析其與RS的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或配對(duì)卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者組織染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。早期Luminal A型乳腺癌患者中ER、PR均為陽(yáng)性表達(dá)。部分患者HER-2呈陽(yáng)性表達(dá)或陰性表達(dá)，Ki67呈高表達(dá)或低表達(dá)。根據(jù)NCCN指南，只要ER、PR為陽(yáng)性，即進(jìn)行內(nèi)分泌治療，且隨ER、PR陽(yáng)性率增高，其內(nèi)分泌治療效果越明顯。

A：ER(+)；B：ER(-)；C：PR(+)；D：PR(-)；E：HER-2()；F：HER-2(-)；G：Ki67高表達(dá)；H：Ki67低表達(dá)

2.2 21基因檢測(cè)及RS評(píng)估前后治療決策對(duì)比 見(jiàn)表1。21基因檢測(cè)及RS評(píng)估前，初步確定66例(37.9%)適用于H方案，均為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者；108例(62.1%)患者適用于CH方案，其中低風(fēng)險(xiǎn)者66例(37.9%)，中高風(fēng)險(xiǎn)者42例(24.2%)。經(jīng)21基因檢測(cè)進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后決策發(fā)生變化，共132例(75.9%)建議進(jìn)行H方案治療，其中66例(37.9%)從建議進(jìn)行CH方案治療改為H方案治療，低風(fēng)險(xiǎn)者48例(27.6%)，中高風(fēng)險(xiǎn)者18例(10.3%)；建議進(jìn)行CH方案者42例(24.2%)，其中低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者6例(3.5%)，中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者36例(20.7%)，無(wú)增加輔助化療者。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，21基因檢測(cè)及RS評(píng)估前后治療方案比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

表1 21基因檢測(cè)及RS評(píng)估前后治療決策對(duì)比[例(% )]

2.3 臨床特征與RS相關(guān)性分析 見(jiàn)表2。復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、病理組織學(xué)分級(jí)等無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)，而與Ki67表達(dá)及脈管癌栓相關(guān)(均P<0.01)。

表2 臨床特征與RS相關(guān)性分析[例(% )]

3 討 論

多數(shù)惡性腫瘤早期均無(wú)明顯癥狀、體征，乳腺癌患者在這方面尤其顯得突出。但隨著人們健康意識(shí)增強(qiáng)，很多乳腺癌患者通過(guò)體檢發(fā)現(xiàn)乳腺腫塊并通過(guò)其他手段得以確診，因此早期乳腺癌患者增加。隨著診療技術(shù)逐漸完善，早期乳腺癌患者經(jīng)系統(tǒng)規(guī)范的綜合治療后，大多數(shù)取得較好預(yù)后[9]。乳腺癌為高度異質(zhì)性疾病，其分子分型又稱(chēng)為L(zhǎng)uminal分型，是臨床上根據(jù)乳腺癌的免疫組化染色結(jié)果表現(xiàn)進(jìn)行劃分的，至少分為十幾個(gè)亞型，因技術(shù)條件所限，臨床上無(wú)法精準(zhǔn)分型，常分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、HER-2陽(yáng)性及三陰性乳腺癌[10-11]，其中Luminal A型為較常見(jiàn)分子亞型，復(fù)發(fā)率低，對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，對(duì)化療不敏感。乳腺癌21基因檢測(cè)的21個(gè)基因由6組基因組合而成，其中5組腫瘤相關(guān)基因包括增殖相關(guān)基因(Ki67、STK15、Survivin、Cyclin B1、Mybl2)、侵襲相關(guān)基因(Stromely sin3、Cathepsin L2)、HER-2相關(guān)基因(GRB7、HER-2)、激素相關(guān)基因(ER、PR、Bcl-2、Scube2)、其他基因(GSTM1、BAG1、CD68)以及內(nèi)參基因(β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)[12-13]，然而目前關(guān)于21基因檢測(cè)在Luminal A型患者治療中的指導(dǎo)意義研究甚少。

楊玉慶等[14]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，與低危組比較，中高危組接受化療的患者更多；相較于21基因檢測(cè)之前，低危浸潤(rùn)性癌有較明顯的治療決策改變。本研究中，21基因檢測(cè)及RS評(píng)估前初步確定66例適用于采用H方案，均為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者分別，占37.9%，而108例患者適用于CH方案，其中低風(fēng)險(xiǎn)、中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者分別占37.9%和24.2%；經(jīng)21基因檢測(cè)進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后決策發(fā)生變化，共計(jì)132例建議進(jìn)行H方案治療，其中66例(37.9%)從建議進(jìn)行CH方案治療改為H方案治療，低風(fēng)險(xiǎn)者48例(27.6%)，中高風(fēng)險(xiǎn)者18例(10.3%)；建議進(jìn)行CH方案治療者42例(24.2%)，其中低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者6例，中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)者36例，無(wú)增加輔助化療者。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，21基因檢測(cè)及RS評(píng)估前后治療方法比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明21基因檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)Luminal A型乳腺癌患者的治療有積極意義。

通過(guò)21基因檢測(cè)獲得的RS針對(duì)早期Luminal A型乳腺癌患者比傳統(tǒng)臨床病理指標(biāo)更能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)臨床結(jié)果并用于臨床實(shí)踐。RS可作為預(yù)測(cè)早期Luminal A型乳腺癌患者遠(yuǎn)期是否有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的量化指標(biāo)。高RS早期Luminal A型乳腺癌患者從CH方案治療中會(huì)有較大獲益；對(duì)于低RS早期Luminal A型乳腺癌患者來(lái)說(shuō)，無(wú)需輔助化療，進(jìn)行H方案治療即可；對(duì)中RS早期Luminal A型乳腺癌患者來(lái)說(shuō)，CH方案治療能否降低疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)目前沒(méi)有明確結(jié)論，還需要后續(xù)進(jìn)一步研究。本研究證明，使用21基因檢測(cè)及RS分級(jí)來(lái)判斷患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的高低對(duì)早期Luminal A型乳腺癌患者治療方案選擇具有重要臨床指導(dǎo)意義[15]。Wang等[16]也發(fā)現(xiàn)，在所有乳腺癌患者中，高RS被認(rèn)為是推薦化療最重要的影響因素。對(duì)具有高RS的Luminal A樣亞型患者或具有低RS的Luminal B型患者，已證明21基因的RS為推薦化療最重要的獨(dú)立因素。因此，21基因RS是影響化學(xué)療法決策的重要因素，值得進(jìn)一步臨床評(píng)估。

洪進(jìn)等[17]發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、月經(jīng)狀態(tài)為影響Luminal A型早期乳腺癌化療決策的重要因素，70歲以上患者或淋巴結(jié)陰性的絕經(jīng)后患者傾向于不接受化療。Wu等[18]認(rèn)為，組織分級(jí)、PR狀態(tài)、Ki67均為RS的獨(dú)立影響因素。瞿飛麟等[19]發(fā)現(xiàn)，在激素受體陽(yáng)性早期乳腺癌患者中，孕激素受體(PGR)、Ki67及組織學(xué)分級(jí)為影響RS的獨(dú)立影響因素。由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)本制作程序以及Ki67表達(dá)陽(yáng)性率檢測(cè)方法及其臨床界值界定，目前區(qū)分Ki67高低表達(dá)的臨界值從3.5%～34%均有報(bào)道。本研究考慮到不同實(shí)驗(yàn)室Ki67表達(dá)陽(yáng)性率檢測(cè)方法不同可能造成結(jié)果很大程度上的差異，及對(duì)化療可能受益的Luminal A型乳腺癌治療不足的可能，因此選擇較低界值(14%)進(jìn)行界定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)21基因RS有一定影響。本研究也發(fā)現(xiàn)21基因檢測(cè)及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分組與早期Luminal A型乳腺癌患者年齡、組織病理學(xué)分級(jí)(1～2級(jí))、女性月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑等無(wú)相關(guān)性，而與Ki67及有無(wú)脈管癌栓呈正相關(guān)。對(duì)于早期Luminal A型乳腺癌患者來(lái)說(shuō)，這些既往被歸為增加復(fù)發(fā)危險(xiǎn)分級(jí)的因素可通過(guò)21基因檢測(cè)給予RS所替代，RS分析的作用顯著優(yōu)于年齡和腫瘤大小作為獨(dú)立預(yù)后因素的作用[20-21]。

綜上所述，21基因檢測(cè)對(duì)早期Luminal A型乳腺癌患者的治療決策具有一定指導(dǎo)意義，RS僅與Ki67表達(dá)、脈管癌栓有相關(guān)性，因此可通過(guò)21基因檢測(cè)給予RS替代年齡、腫瘤直徑等作為獨(dú)立預(yù)后因素。但本研究也有一定不足之處：對(duì)于早期Luminal A型乳腺癌患者無(wú)病生存和總生存數(shù)據(jù)仍在進(jìn)一步收集中，目前還無(wú)法得出結(jié)論；此外，由于研究周期及經(jīng)濟(jì)成本等原因，本研究患者入組例數(shù)較少，暫無(wú)法從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度對(duì)21基因檢測(cè)進(jìn)行成本效益分析。上述不足將在后續(xù)工作中加以完善，以提高21基因檢測(cè)及RS在早期Luminal A型乳腺癌患者臨床實(shí)踐中的地位。