顧 勇，楊 艷，符 翠，崔 婷，王 艷

(1.武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710054；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院，陜西 西安 710032；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710004)

伴隨著人們生活方式調(diào)整，飲食成分和結(jié)構(gòu)變化，以及環(huán)境污染、生態(tài)破壞等因素，大腸癌在我國(guó)的發(fā)病率與病死率逐年上升的趨勢(shì)仍舊明顯，盡管近年在防治上有一定成效，但是年齡標(biāo)化5年相對(duì)生存率仍以每年2.9%的速率上升，總生存率依舊維持在50%～60%。結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在全部惡性腫瘤中分別位居第3位和第5位，嚴(yán)重危害我國(guó)人民的生命健康[1-3]。體內(nèi)外研究[4-6]證實(shí)白藜蘆醇(Resveratrol，Res)作為天然植物藥物，可通過(guò)不同信號(hào)途徑抑制癌細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)抗炎、抗氧化和抗血管生成等起到防癌和抑癌作用。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Res對(duì)消化系統(tǒng)(肝臟、胃、食管等)腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤以及卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、黑色素瘤等其他多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制作用[7-9]，而其對(duì)結(jié)腸癌的作用目前研究相對(duì)較少。本研究采用體內(nèi)試驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，進(jìn)一步深入探討Res對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)行為的影響，為有效防治結(jié)腸癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HT-29、SW480和 LoVo細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；Res(批號(hào)：BJ-ATCC0154)購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)HT-29、SW480和LoVo細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(105/ml)，采用不同劑量Res進(jìn)行處理并分組。對(duì)照組不加Res；低劑量組加入Res 25 μmol/L；中劑量組加入Res 50 μmol/L；高劑量組加入Res 100 μmol/L。處理時(shí)間為24 h。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29、SW480和LoVo細(xì)胞接種于96孔板中，分別在0、24、48、72、96 h時(shí)向每孔加入10 μl CCK-8溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：收集各組處理后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29、SW480和 LoVo細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，重懸后用70%預(yù)冷乙醇固定，PBS洗滌2次，加入碘化丙錠(PI)染液(PI 50 mg/L,Triton X-100 1.0%，核糖核酸酶A 10 mg/L)染色30 min后4 ℃避光過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量，計(jì)算結(jié)腸癌細(xì)胞周期分布與細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 動(dòng)物模型構(gòu)建：80只SPF級(jí)健康SD大鼠(8周齡，200 g，雌雄各半)在屏障系統(tǒng)內(nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成四組，即對(duì)照組、模型組、Res低劑量組(20 mg/kg)和Res高劑量組(40 mg/kg)。連續(xù)12周給予模型組和實(shí)驗(yàn)組(Res低劑量組和Res高劑量組)大鼠皮下注射1,2-二甲基肼(DMH)30 mg/kg(隔天1次)和1%葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)水自由飲用。對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。模型構(gòu)建后，分別給予每只模型大鼠20、40 mg/kg Res連續(xù)灌胃30 d，計(jì)算結(jié)腸癌誘癌率(荷瘤動(dòng)物只數(shù)/受檢動(dòng)物只數(shù)×100%)和結(jié)腸癌抑制率[(模型組腫瘤誘癌率-實(shí)驗(yàn)組腫瘤誘癌率)/模型組腫瘤誘癌率]。

1.2.5 病理學(xué)組織檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集病變腸道組織，用10%福爾馬林緩沖液固定后包埋。將組織切成4 μm厚的連續(xù)切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下評(píng)估腫瘤病理組織學(xué)改變。

1.2.6 結(jié)腸組織凋亡細(xì)胞檢測(cè)(TUNEL法)：組織切片脫蠟、水化后，利用蛋白酶K充分作用通透細(xì)胞膜和核膜。滴加3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育以滅活切片內(nèi)源過(guò)氧化物酶，隨后用PBS洗滌3次。在樣品上加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃孵育60 min，用PBS洗滌3次。樣品上滴加50 μl DAB顯色液，室溫孵育15 min。用PBS洗滌3次后依次進(jìn)行蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。正常細(xì)胞核顯示為藍(lán)色，呈棕褐色則為凋亡細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)。采用 Image-Pro Plus 6.0 圖像測(cè)量軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。對(duì)數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析或SNK-q檢驗(yàn)；多實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量Res對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響 見(jiàn)圖1。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量Res可以抑制HT-29、LoVo細(xì)胞活力，且隨著Res劑量的增加，細(xì)胞活力顯著降低，呈濃度依賴性；雖然低劑量Res處理后SW480細(xì)胞活力變化不明顯，但隨著Res劑量的增加，SW480細(xì)胞活力仍受到了明顯抑制，考慮與細(xì)胞特異性相關(guān)。

2.2 不同劑量Res對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響 見(jiàn)表1～3。與對(duì)照組比較，不同劑量組HT-29、SW48和LoVo細(xì)胞凋亡率明顯上升，且三種細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著提高，G0/G1期細(xì)胞減少，均呈劑量依賴性(均P<0.05)。

表1 不同劑量Res對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響(%)

2.3 四組大鼠結(jié)腸癌誘癌率及抑制率比較 見(jiàn)表4。與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠結(jié)腸內(nèi)腫瘤數(shù)目和誘癌率明顯降低(均P<0.05)。高劑量組大鼠結(jié)腸癌抑制率高于低劑量組(P<0.05)。

表2 不同劑量Res對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響(%)

表3 不同劑量Res對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響(%)

表4 四組大鼠結(jié)腸癌誘癌率及抑制率比較

2.4 四組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果 見(jiàn)圖2。對(duì)照組黏膜紅潤(rùn)正常，皺褶規(guī)則，腺管結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組黏膜異常增厚，皺褶變粗且形狀不規(guī)則；可見(jiàn)大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)，浸潤(rùn)深達(dá)漿膜，貫穿整個(gè)結(jié)腸；腺管排列擁擠紊亂，間質(zhì)少，正常腺管結(jié)構(gòu)消失；癌細(xì)胞大小不一，呈條索狀、簇狀排列；腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，細(xì)胞間隙消失。Res低劑量組和Res高劑量組病理改變較模型組減輕，腫瘤僅局限于黏膜層和肌層。

對(duì)照組 模型組 Res低劑量組 Res高劑量組

A、B：對(duì)照組；C、D：模型組；E、F：Res低劑量組；G、H：Res高劑量組。放大倍數(shù)：A、C、E、G，×40；B、D、F、H，×100

2.5 四組大鼠結(jié)腸組織凋亡細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖3。與模型組相比，隨著Res劑量的增高，Res低劑量組和Res高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。

3 討 論

有研究認(rèn)為結(jié)腸癌發(fā)病率可作為國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的一個(gè)重要標(biāo)志，在一些有過(guò)發(fā)展大轉(zhuǎn)型經(jīng)歷的國(guó)家，其發(fā)病率隨著人類發(fā)展指數(shù)升高而上升[10-11]。目前，盡管在機(jī)制研究和臨床診療方面取得了一定進(jìn)展，但是各種治療方案在耐受性、療效和交叉抗性方面都有缺陷，進(jìn)展期結(jié)腸癌遠(yuǎn)期療效仍然較差[12]。在我國(guó)，中醫(yī)藥資源相對(duì)豐富，在傳統(tǒng)中草藥中探求高效低毒的抑癌成分及相關(guān)機(jī)制將促進(jìn)腫瘤綜合治療的發(fā)展。

Res為多酚類化合物，又稱芪三酚，是腫瘤的化學(xué)預(yù)防劑，也可以作為減少血小板聚集、預(yù)防和治療心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑[13]。目前它已被證實(shí)具有抗血栓、抗突變、抗自由基、抗心血管疾病、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等生物活性劑藥理作用。Res還可以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)及促進(jìn)組織器官損傷愈合等[14]。其中，它的抗腫瘤作用成為多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究[15-16]顯示，Res對(duì)正常組織和細(xì)胞僅有較低毒性或者無(wú)毒，有可能成為更精準(zhǔn)的新型綠色抗腫瘤藥物，故其在腫瘤輔助治療中具有較大的潛在臨床價(jià)值。本研究首先在體外利用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Res對(duì)結(jié)腸癌HT-29、SW480和LoVo細(xì)胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)Res可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性。既往研究[17-18]在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，證實(shí)Res對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖均具有抑制作用。

細(xì)胞周期阻滯在抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖中起到重要作用[19]。研究[20]表明，Res可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制口腔癌的增殖。Res還可以通過(guò)上調(diào)促凋亡基因抑制抗凋亡基因的表達(dá)，將前列腺癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而抑制前列腺癌增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[21-22]。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同劑量Res處理后結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)隨著Res劑量的增高，HT-29、SW480和LoVo細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞比例提高，G0/G1期細(xì)胞減少，且呈劑量依賴性。但Res影響結(jié)腸癌細(xì)胞周期的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步證實(shí)Res能否在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌增殖，本研究利用DSS水構(gòu)建大鼠結(jié)腸癌模型并給予不同劑量Res，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Res顯著抑制了結(jié)腸癌模型大鼠的腫瘤大小。TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Res可顯著促進(jìn)體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌發(fā)展。此結(jié)果與上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了Res對(duì)結(jié)腸癌的抑制作用。

綜上所述，Res可抑制體外結(jié)腸癌HT-29、SW480和LoVo細(xì)胞增殖，促進(jìn)體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，為結(jié)腸癌的新型藥物治療提供了新的思路。但由于Res生物利用率低，目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的產(chǎn)品主要為保健用品，而非藥品，因此需要開展更大規(guī)模的研究,以促進(jìn)Res藥用價(jià)值的開發(fā)，使其成為新型、高效、低毒的抗結(jié)腸癌藥物。