王 徽，白玉勤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學(xué)院第二附屬醫(yī)院 赤峰市腫瘤醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

肺癌的發(fā)生率和病死率居我國惡性腫瘤之首，研究肺癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制對于臨床診療具有重要意義[1]。肺癌蛋白組學(xué)是目前的研究熱點，分析肺癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)差異可為肺癌的藥物治療研發(fā)提供依據(jù)。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶受體A7(Ephrin receptor A7，EphA7)在惡性腫瘤中呈高表達(dá)，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，但其與肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究尚未見報道。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種信號傳導(dǎo)通路的分子受體，但其與肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚存在爭議[4-5]。Ki67蛋白是細(xì)胞有絲分裂與增殖的重要蛋白，反映腫瘤細(xì)胞增殖的活躍度[6]，但其對肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移是否存在影響值得研究。因此，本研究通過制備A549肺腺癌移植瘤裸鼠模型探討肺腺癌移植瘤侵襲組織中EphA7、EGFR、Ki67蛋白表達(dá)水平及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞 Balb/C裸鼠20只，雄性，鼠齡7～8周，體重24～28 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0005。裸鼠飼養(yǎng)符合我國動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，實驗前均經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)。肺腺癌A549細(xì)胞株由日本東北大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 實驗試劑 羊抗鼠血清蛋白(批號：ZA16388)購自北京中杉金橋公司；兔抗人EGFR單克隆抗體(批號：ZA0568)購自北京中杉金橋公司；兔抗人EphA7多克隆抗體(批號：715-475-150)購自美國Santa Cruz公司；兔抗人Ki67單克隆抗體(批號：180321)購自北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(批號：190805)購自北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司；20%小牛血清(批號：180803)和RPMI-1640培養(yǎng)液(批號：191024)購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肺腺癌移植瘤裸鼠模型制備：肺腺癌A549細(xì)胞株培養(yǎng)于含有20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，采用細(xì)胞培養(yǎng)移植法，先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并傳代，每個培養(yǎng)皿中僅加入1 ml完全培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞株，置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d觀察細(xì)胞貼壁生長情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞貼壁后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞制備5×107個/ml細(xì)胞懸液，皮下注射到裸鼠背部靠近頭部區(qū)域。接種后第2周若發(fā)現(xiàn)接種部位出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)，游標(biāo)卡尺測量瘤體直徑在30 mm以上，體積在1000 mm3以上，表示模型制備成功。

1.3.2 肺腺癌移植瘤組織標(biāo)本處理：使用乙醚麻醉肺腺癌移植瘤模型裸鼠，剪開背部皮膚，暴露移植瘤。利用活體冷凍技術(shù)，使用-196 ℃液氮下異戊烷-丙烷冷凍液將肺腺癌移植瘤組織冷凍，并用電鉆取下肺腺癌移植瘤侵襲組織和旁邊2 cm外的非侵襲組織。將取下的瘤組織置于4%多聚甲醛中固定72 h，然后石蠟包埋，分別制作侵襲組織切片和非侵襲組織切片。

1.3.3 免疫組化法檢測EphA7、EGFR、Ki67蛋白表達(dá)：石蠟切片浸泡于抗原修復(fù)工作液中加熱煮沸20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。滴加10%羊抗鼠血清蛋白孵育30 min。按照SP法免疫組化染色，先加入兔抗人EphA7單克隆抗體(一抗)100 μl，室溫孵育60 min，再4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。磷酸鹽緩沖液作為一抗的陰性對照。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的EphA7二抗，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。滴加DAB顯色液50 μl處理5～10 min，自來水終止顯色，在顯微鏡下觀察切片。由病理中心2名醫(yī)師獨立閱片，采用Bresalier半定量法分析，每張切片隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野，分染色深淺度評分和陽性細(xì)胞率評分兩部分。①染色深淺度評分：0分為不顯色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②陽性細(xì)胞率評分：0分為陽性細(xì)胞率<5%；1分為陽性細(xì)胞率5%～25%；2分為陽性細(xì)胞率26%～50%；3分為陽性細(xì)胞率51%～75%；4分為陽性細(xì)胞率≥76%。上述累計得分0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強(qiáng)陽性。EGFR蛋白采用的免疫組化染色步驟和方法同上，使用兔抗人EGFR單克隆抗體試劑盒。Ki67蛋白采用的免疫組化染色步驟和方法同上，使用兔抗人Ki67單克隆抗體試劑盒。

2 結(jié) 果

2.1 侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達(dá)情況比較 見表1(圖1)。肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達(dá)均為陽性，陽性細(xì)胞表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達(dá)情況比較

A：陰性對照，無EphA7蛋白表達(dá)(×100)；B：侵襲組織EphA7蛋白表達(dá)陽性(×400)；C：非侵襲組織EphA7蛋白表達(dá)陽性(×400)

2.2 侵襲組織與非侵襲組織EGFR蛋白表達(dá)情況比較 見圖2A。肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織EGFR蛋白表達(dá)均為陰性。

2.3 侵襲組織與非侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)情況比較 見表2(圖2B、C)。肺腺癌移植瘤侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)均為陽性，非侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)為陰性或弱陽性，侵襲組織陽性細(xì)胞表達(dá)率高于非侵襲組織(P<0.05)。

表2 侵襲組織與非侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)情況比較

A：侵襲組織EGFR蛋白表達(dá)陰性(×200)；B：侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)陽性(×400)；C：非侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)陰性(×400)

3 討 論

腫瘤侵襲是肺癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移、進(jìn)展的重要病理基礎(chǔ)。本研究通過皮下接種肺腺癌A549細(xì)胞的方式建立肺腺癌移植瘤裸鼠模型，再通過免疫組化染色觀察肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織中EphA7、EGFR、Ki67蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行半定量分析，可為病理機(jī)制研究提供參考。常規(guī)的免疫組化染色容易受組織細(xì)胞壞死變性、抗原封閉等影響而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果判定誤差較大。基于此，本研究利用活體冷凍技術(shù)，使用-196 ℃液氮下異戊烷-丙烷冷凍液將肺腺癌移植瘤組織冷凍，在活體狀態(tài)下瞬間冷凍靶器官組織，最大限度地保留組織原有形態(tài)和代謝，減少組織細(xì)胞壞死變性、紅細(xì)胞破裂釋放的過氧化酶與底物作用而產(chǎn)生非抗原特異性的陽性著色，提高本研究免疫組化染色的準(zhǔn)確性[7]。

EphA7是Eph受體家族中的一員[8]。近年來研究[9-11]發(fā)現(xiàn)EphA7蛋白在骨肉瘤、前列腺癌、口腔鱗癌中呈陽性表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其高表達(dá)預(yù)示著總生存期縮短。本研究顯示，肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織EphA7蛋白表達(dá)均為陽性，但陽性細(xì)胞表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明EphA7蛋白表達(dá)與肺腺癌侵襲進(jìn)展無明顯關(guān)系，無論是在侵襲組織還是在非侵襲組織中均表達(dá)上調(diào)。金紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，EphA7可能通過PTEN-AKT通路調(diào)控癌細(xì)胞的遷移和侵襲。國外研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，EphA7蛋白與腫瘤血管形成有密切關(guān)系，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤血管形成，從而增加腫瘤血管微密度，保障腫瘤血供，為腫瘤侵襲創(chuàng)造條件。

EGFR是一種跨膜糖蛋白，其信號通路與細(xì)胞生長、增殖密切相關(guān)[15]。EGFR在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，其機(jī)制可能是EGFR增強(qiáng)下游信號傳導(dǎo)，如RAS/RAF/MAPK通路、PI3K/AKT通路和JAK/STAT通路[16]。突變型EGFR受體表達(dá)增加也會導(dǎo)致EGFR持續(xù)活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖與抗凋亡，EGFR突變一般預(yù)示著腫瘤預(yù)后差[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌移植瘤侵襲組織與非侵襲組織中EGFR蛋白表達(dá)均為陰性，提示EGFR蛋白表達(dá)與肺腺癌侵襲進(jìn)展無明顯關(guān)系，與既往研究[19]結(jié)果相似。

Ki67是惡性腫瘤預(yù)后不良的臨床常見標(biāo)志物[20]。Ki67蛋白參與細(xì)胞有絲分裂與增殖，一般認(rèn)為Ki67蛋白表達(dá)越高，惡性腫瘤細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)，惡性程度越高。本研究顯示，肺腺癌移植瘤侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)均為陽性，非侵襲組織Ki67蛋白表達(dá)為陰性或弱陽性，侵襲組織陽性細(xì)胞表達(dá)率高于非侵襲組織，說明Ki67蛋白表達(dá)可能會影響肺腺癌侵襲，Ki67陽性表達(dá)率越高，肺癌細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

綜上所述，EphA7、EGFR蛋白表達(dá)與肺腺癌侵襲進(jìn)展無明顯關(guān)系，Ki67蛋白表達(dá)可能影響肺腺癌侵襲。