李雙雙，曾瑞霞

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2.錦州市中心醫(yī)院血液科，遼寧 錦州 121001)

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)主要應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療，因此需要在體外培養(yǎng)并大量擴(kuò)增以供應(yīng)臨床移植使用[1-5]。迄今為止，在擴(kuò)增MSCs時(shí)多使用胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)作為輔助添加劑[6]。FBS在培養(yǎng)MSCs時(shí)展現(xiàn)出來一些良好的性質(zhì)，如含有很多細(xì)胞生長和增殖所需的因子，能夠在MSCs擴(kuò)增很多代后仍保持原始屬性，具有支持MSCs多向分化潛能等。然而，人們對(duì)于FBS的安全性產(chǎn)生了許多擔(dān)憂，因?yàn)镕BS可以攜帶朊病毒(引起瘋牛病)、異種抗原或其他引起人畜共患傳播病原體并感染培養(yǎng)細(xì)胞，繼而這些細(xì)胞將給接受移植治療的患者造成嚴(yán)重的并發(fā)癥[7]。為了解決以上這些問題，我們準(zhǔn)備改進(jìn)或設(shè)計(jì)新的培養(yǎng)/擴(kuò)增細(xì)胞的方法，并將重點(diǎn)放在無任何動(dòng)物衍生產(chǎn)品添加劑的培養(yǎng)基上。有研究[8]嘗試用人血清替換FBS，但發(fā)現(xiàn)其對(duì)MSCs的擴(kuò)增、增殖和分化作用不佳。而人血小板裂解產(chǎn)物(Platelet lysis product，PL)在培養(yǎng)MSCs時(shí)具有非常好的前景，因?yàn)镻L中包含大量轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(IGF)，可以有效地支持MSCs體外培養(yǎng)。因此，本研究將人外周血血小板裂解物(Peripheral blood platelet lysate，PB-PL)與FBS進(jìn)行對(duì)照研究，以評(píng)估其作為培養(yǎng)人臍帶MSCs添加劑使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 外周血和臍帶收集：從血站收集剛過期的外周血，每份大約500 ml，共10份。在患者知情同意后，從正常分娩(妊娠36～40周)胎盤上收集新鮮人類臍帶(5～10 cm)5個(gè)，由產(chǎn)科手術(shù)室助產(chǎn)士完成。臍帶存儲(chǔ)在4 ℃磷酸緩沖鹽(添加10 U/ml青霉素和 10 μg/ml鏈霉素)中，在 12 h內(nèi)完成細(xì)胞分離處理。

1.1.2 主要試劑：低糖DMEM/F12、FBS、地塞米松、抗壞血酸、抗壞血酸2-磷酸酯、MEM培養(yǎng)基、DMEM-G培養(yǎng)基、PBS(Gibco公司)；茜素紅、阿新蘭、臺(tái)盼藍(lán)、油紅O、胰蛋白酶-EDTA (武漢博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PB-PL制備：將5份外周血混合到一起迅速進(jìn)行裂解離心，提取裂解產(chǎn)物。用血液分析儀分析每份血液的血小板總數(shù)。900 g離心15 min后，收集含有血漿和血小板的上清液，再次對(duì)上清以4000 g離心15 min并收集上清。在-80 ℃儲(chǔ)存至少12 h后，在4 ℃下解凍溶解12 h，并以4000 g離心30 min。使用0.65 μm過濾器過濾上清，制備PB-PL，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 臍帶MSCs分離、培養(yǎng)及形態(tài)觀察：將臍帶內(nèi)的華通膠組織剪成小塊(1～3 mm3)，放入6孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。當(dāng)附著細(xì)胞數(shù)量足夠時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，PBS清洗后重新放入75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 U/ml青霉素和10 μg/ml鏈霉素的低糖DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中分別添加15% FBS(FBS組)和10% PB-PL(PB-PL組)進(jìn)行培養(yǎng)，在達(dá)到80%融合時(shí)，細(xì)胞再次傳代，采用第3代細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.2.3 MSCs細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)觀察：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，0.5 ml懸液加入試管中。加入0.4%臺(tái)盼蘭染液染色2～3 min。吸取少許懸液涂于載玻片上，鏡下取幾個(gè)任意視野分別統(tǒng)計(jì)死亡細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(%)=未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。采用第3代細(xì)胞，以1000個(gè)/cm2密度種植于培養(yǎng)皿中，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間(CDT)。CDT=[lg(N/N0)/lg2]×T，其中N為終止培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞數(shù)量，N0為種植開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量，T為培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.4 人臍帶MSCs分化能力檢測：細(xì)胞植入6孔板中。成骨分化采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)臍帶MSCs，添加成骨性添加物(0.01 mmol/L地塞米松和50 μg/ml抗壞血酸)，25 d后用茜素紅染色法對(duì)成骨分化進(jìn)行評(píng)估。成軟骨分化采用DMEM-G(高糖)培養(yǎng)基，添加0.01 mmol/L地塞米松、35 μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯、10 ng/ml TGF-β1，培養(yǎng)28 d后10%福爾馬林固定，阿新蘭染色檢測。成脂肪分化采用含成脂肪添加成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)對(duì)MSCs進(jìn)行脂肪分化，25 d后通過油紅O染色檢測成脂情況。

1.2.5 集落形成能力檢測：第2、3、4和5代MSCs分別用含F(xiàn)BS或PB-PL的培養(yǎng)基培養(yǎng)，行成纖維細(xì)胞克隆形成單位(CFU-F)檢測。各組MSCs經(jīng)胰酶消化、計(jì)數(shù)，以500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔培養(yǎng)板上，以添加FBS或PB-PL的MSCs生長培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周更換2次培養(yǎng)基，經(jīng)過15 d培養(yǎng)后，細(xì)胞用10%福爾馬林固定，采用吉姆薩染色，計(jì)算染色的CFU-F數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組MSCs生長情況比較 見圖1。FBS組第4天可見黏附性貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，而PB-PL組第6天時(shí)可見貼壁細(xì)胞出現(xiàn)。12 d后進(jìn)行傳代，貼壁細(xì)胞生長過程中形態(tài)較一致，為梭形。PB-PL組細(xì)胞體積較小。兩組MSCs形態(tài)均能維持8代以上。

2.2 兩組MSCs生長動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 見表1。在第2代時(shí)，F(xiàn)BS組MSCs細(xì)胞活性低于PB-PL組(P<0.05)。在第5 代時(shí)，F(xiàn)BS組MSCs的CDT高于PB-PL組(P<0.01)。

表1 兩組MSCs生長動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 兩組MSCs分化能力比較 見圖2。將第3代MSCs置于成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，兩組MSCs都出現(xiàn)了鈣化組織沉積，茜素紅染色陽性。與FBS組相比，PB-PL組細(xì)胞染色更強(qiáng)，鈣沉積更穩(wěn)定。在成脂肪培養(yǎng)條件下培養(yǎng)21 d后，兩組MSCs均表現(xiàn)出油紅O染色陽性，可見少量脂質(zhì)包裹體，提示脂肪細(xì)胞分化欠成熟。誘導(dǎo)MSCs向軟骨系分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，PB-PL組MSCs糖胺聚糖含量高于FBS組。

A-C：PB-PL組第1、5、10代臍帶MSCs形態(tài)；D-F：FBS組第1、5、10代臍帶MSCs形態(tài)

2.4 兩組MSCs成纖維細(xì)胞集落形成能力比較 見表2。經(jīng)15 d培養(yǎng)，采用吉姆薩法固定并染色后發(fā)現(xiàn)，MSCs在培養(yǎng)初期能夠快速形成集落樣成纖維細(xì)胞群，第4代時(shí)FBS組MSCs集落生成數(shù)量達(dá)到最大，而PB-PL組MSCs集落生成數(shù)量最多的時(shí)期出現(xiàn)在第5代。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，第2～5代兩組MSCs集落生成能力比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表2 兩組MSCs成纖維細(xì)胞集落形成能力比較(個(gè))

3 討 論

本研究在擴(kuò)增臍帶MSCs的培養(yǎng)基中添加15% FBS或10% PB-PL，以對(duì)比不同添加劑對(duì)人臍帶MSCs增殖及分化的影響。血小板裂解產(chǎn)物從剛剛過期的人外周血中提取，平均血小板濃度為(2.23±0.16)×106/ml。為避免不同批次外周血性質(zhì)的變化，我們將收集的外周血混合到一起，然后迅速進(jìn)行裂解離心并提取裂解產(chǎn)物的辦法，這樣可以有效地避免血小板裂解物個(gè)體屬性差異性大的問題。

本研究顯示，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)6 d后，15% FBS和10% PB-PL都成功地從人臍帶組織中分離培養(yǎng)出MSCs。臍帶MSCs在15% FBS或10% PB-PL培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，其形態(tài)一直能維持傳代到第8代以上。經(jīng)10% PB-PL擴(kuò)增的臍帶MSCs的體積較Chevallier等[8]報(bào)道的添加15% FBS培養(yǎng)的臍帶MSCs要小。經(jīng)兩種不同添加劑培養(yǎng)基培養(yǎng)后的臍帶MSCs均向成骨和成軟骨系方向分化。與Chevallier等的研究進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，MSCs成脂肪分化結(jié)果不是十分理想，最終分化的是一種不成熟的脂肪表型，油紅O染色后幾乎沒有發(fā)現(xiàn)有脂質(zhì)包裹體[9]，這可能是由于臍帶MSCs的胚胎起源以及我們采用的分化方案有所不同所致[10-14]。阿新蘭染色顯示，在10% PB-PL培養(yǎng)的臍帶MSCs中，糖胺聚糖含量高于15% FBS培養(yǎng)的臍帶MSCs，與既往研究[15-17]一致。在誘導(dǎo)臍帶MSCs向成骨分化時(shí)，與Chevallier等的研究相比，我們發(fā)現(xiàn)10% PB-PL培養(yǎng)的臍帶MSCs中鈣沉積增加，且沉積更穩(wěn)定。在這兩項(xiàng)研究中，從開始分離到擴(kuò)增MSCs都是使用PB-PL培養(yǎng)基。而成骨誘導(dǎo)后的礦化水平不同可能是所使用的MSCs來源不同所致，一個(gè)是骨髓來源，一個(gè)是臍帶來源[18]。

與FBS培養(yǎng)基相比，在培養(yǎng)基中使用相對(duì)少量的PB-PL，細(xì)胞生長加快，細(xì)胞數(shù)量增加。通過計(jì)算第1～5代臍帶MSCs的CDT證實(shí)了這一點(diǎn)。特別是在第5代，PB-PL培養(yǎng)的臍帶MSCs平均CDT短于FBS培養(yǎng)的臍帶MSCs平均CDT。因此，PB-PL培養(yǎng)臍帶MSCs時(shí)可能吸收了更多的生長因子，使其擴(kuò)增速度大大增加[19]。在第5代時(shí)，兩組細(xì)胞的生存能力沒有任何差異，F(xiàn)BS擴(kuò)增的臍帶MSCs的平均值為(85±4%)，而PB-PL擴(kuò)增的臍帶MSCs為(86±3)%。針對(duì)臍帶MSCs的集落形成能力，我們進(jìn)行了CFU-F檢測。與FBS擴(kuò)增的臍帶MSCs相比，PB-PL培養(yǎng)的MSCs的CFU-F數(shù)量雖然更高，但分析發(fā)現(xiàn)并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臍帶MSCs的集落形成和維持能力進(jìn)一步表明了其自我更新和復(fù)制能力[20]。

綜上所述，通過在培養(yǎng)基中添加PB-PL，能夠成功分離和擴(kuò)增臍帶MSCs。此外，當(dāng)比較PB-PL和FBS培養(yǎng)的臍帶MSCs特性時(shí)，PB-PL培養(yǎng)的MSCs顯示出了更高的生長速率、三系分化和干細(xì)胞原始屬性，這為臨床上使用PB-PL替代傳統(tǒng)FBS作為添加劑培養(yǎng)MSCs提供了依據(jù)。