崔 凱，白峻峰，支亞男，姜 琨，王壯壯，公孫鑫

(西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院胸腔外科，陜西 西安 710100)

肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移受缺氧和腫瘤血管兩個(gè)重要因素的調(diào)控[1-3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在肺癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)[4-5]，而miRNA參與了腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)[6]。研究[7-9]表明，miR-23a通過(guò)外泌體的轉(zhuǎn)移參與調(diào)控鼻咽癌相關(guān)的血管生成，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移；第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)通過(guò)抑制下游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。目前肺癌組織中VEGF異常表達(dá)介導(dǎo)腫瘤血管生成的機(jī)制尚不明確。本研究擬探究外泌體miR-23a對(duì)NSCLC血管生成的影響，并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 H1299細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自Takara公司；PTEN(No.9863464)、AKT(No.7645465)、磷酸化AKT(p-AKT，No.9863464)、VEGF(No.6754365)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(No.6545324)購(gòu)自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化染色：對(duì)NSCLC患者癌組織及癌旁組織樣本進(jìn)行石蠟包埋、切片后脫蠟和水化。3% H2O2和0.01 mol/L枸櫞酸鈉鹽溶液進(jìn)行抗原修復(fù)。5% BSA封閉液室溫封閉1 h，PTEN和VEGF一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日加二抗室溫孵育，中性樹(shù)膠封片[8]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：完全培養(yǎng)液培養(yǎng)H1299細(xì)胞，6×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照RNA(對(duì)照組)、miR-23a mimic(miR-23a mimic組)和miR-23a inhibitor(miR-23a inhibitor組) 8 h后換新鮮完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下孵箱培養(yǎng)，分別于24、48 h后收集細(xì)胞及其上清。

1.2.3 ELISA實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)miR-23a過(guò)表達(dá)或抑制后H1299細(xì)胞中PTEN和VEGF的表達(dá)水平。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)RNA表達(dá)：TRIzol提取總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，反應(yīng)嚴(yán)格按照Takara公司2×SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行操作?；蛳鄬?duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算。qRT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中加入RIPA裂解液提取總蛋白，隨后加緩沖液，100 ℃煮5 min。緊接著進(jìn)行SDS-PACE電泳分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)膜至PVD膜，轉(zhuǎn)膜條帶脫脂牛奶封閉，清洗后孵育一抗(本研究所有抗體比例1∶1000)，4 ℃冰箱過(guò)夜。次日孵育二抗，PBST緩沖液清洗，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織PTEN、VEGF表達(dá)比較 見(jiàn)圖1。免疫組化結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)明顯低于癌旁組織，而VEGF的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織(均P<0.05)。

注：左圖為癌組織與癌旁組織免疫組化染色結(jié)果(標(biāo)尺=200 nm)；右圖中，與癌旁組織比較，*P<0.01

2.2 miR-23a過(guò)表達(dá)和敲減細(xì)胞系構(gòu)建情況 見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，miR-23a mimic轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后miR-23a表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor以后miR-23a表達(dá)下降(均P<0.05)，表明miR-23a過(guò)表達(dá)和敲減細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.3 三組細(xì)胞PTEN和VEGF表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。ELISA結(jié)果顯示，miR-23a過(guò)表達(dá)明顯抑制H1299細(xì)胞PTEN表達(dá)，增強(qiáng)VEGF表達(dá)，而抑制miR-23a后結(jié)果相反(均P<0.05)。

表2 三組細(xì)胞PTEN和VEGF表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.4 miR-23a對(duì)PTEN、AKT和VEGF mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)圖3。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-23a過(guò)表達(dá)明顯抑制H1299細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)，促進(jìn)AKT和VEGF mRNA表達(dá)；抑制miR-23a可上調(diào)PTEN mRNA表達(dá)，抑制AKT和VEGF mRNA表達(dá)(均P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.5 miR-23a對(duì)PTEN、AKT、p-AKT和VEGF蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖4。Western blot結(jié)果顯示，miR-23a過(guò)表達(dá)明顯抑制H1299細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)，促進(jìn)p-AKT和VEGF蛋白表達(dá)；抑制miR-23a可上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，抑制p-AKT和VEGF蛋白表達(dá)(均P<0.05)。

注：左圖為各蛋白電泳圖；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

3 討 論

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌位居癌癥發(fā)病率和病死率首位[10]。目前，手術(shù)治療仍然是NSCLC的唯一治療方法，但患者術(shù)后生存率仍未明顯改善。近年來(lái)，外泌體已經(jīng)成為治療多種疾病的有效藥物和基因治療轉(zhuǎn)運(yùn)體。外泌體是一類(lèi)直徑20～100 nm的細(xì)胞來(lái)源囊泡，能夠影響血管生成、轉(zhuǎn)移和其他生物細(xì)胞與腫瘤發(fā)生相關(guān)的屬性表皮生長(zhǎng)因子受體[11-12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，癌癥細(xì)胞衍生的微環(huán)境能夠通過(guò)外泌體miRNA促進(jìn)NSCLC發(fā)生與發(fā)展，為揭示腫瘤發(fā)生機(jī)制和潛在新治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。此外，遺傳和表觀遺傳異常如miRNA和基因譜變化，已涉及多種惡性腫瘤發(fā)生。miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA小分子，在NSCLC中表達(dá)異常，其中部分與NSCLC的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[14]。

miRNA是基因表達(dá)的重要介質(zhì)，通過(guò)與蛋白編碼基因mRNA配對(duì)來(lái)引導(dǎo)其抑制。此外，miRNA參與調(diào)控炎癥、細(xì)胞周期進(jìn)展、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化和凋亡等細(xì)胞過(guò)程[15]。有研究[16-17]報(bào)道，miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中癌基因或抑癌基因表達(dá)而影響胃癌的發(fā)生；miRNA在介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞和膀胱癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究[18]發(fā)現(xiàn)，miR-23a/b可通過(guò)靶向PDCD4抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展，提示miR-23a/b具有致瘤作用。另外，miR-23a下調(diào)已被證明能夠負(fù)調(diào)控腫瘤抑制因子和PTEN，而PTEN缺失又促進(jìn)了肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[19]。因此，我們推測(cè)外泌體miR-23a可能通過(guò)靶向PTEN參與NSCLC的發(fā)生。

NSCLC細(xì)胞來(lái)源的miRNA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要意義[20]。miRNAs在惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起重要的促進(jìn)或抑制作用[21]。本研究中，PTEN在NSCLC患者癌組織中表達(dá)較癌旁組織明顯降低，證實(shí)PTEN是miR-23a的靶點(diǎn)。PTEN被報(bào)道在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要的抑癌作用，其高表達(dá)能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞存活率[22]。PTEN缺失能夠誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[23]。此外，PTEN可被miR-718和miR-382協(xié)同靶向，進(jìn)而抑制乳腺癌的血管生成和進(jìn)展。因此，miR-23a可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PTEN促進(jìn)NSCLC血管生成和進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織PTEN表達(dá)低于癌旁組織，而VEGF表達(dá)高于癌旁組織；miR-23a過(guò)表達(dá)明顯抑制H1299細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)AKT、VEGF mRNA以及p-AKT和VEGF蛋白表達(dá)，而抑制miR-23a后結(jié)果相反。上述研究結(jié)果提示外泌體miR-23a可能通過(guò)靶向抑制PTEN促進(jìn)VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)NSCLC腫瘤血管生成，激活肺癌細(xì)胞的異常增殖和遠(yuǎn)端侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，NSCLC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-23a能夠誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)NSCLC的發(fā)展，其機(jī)制可能與靶向抑制PTEN有關(guān)。因此，靶向miR-23a有望為臨床抗NSCLC治療提供新思路和靶點(diǎn)。