張榮臻，呂 超，王 娜，陳月橋，毛德文

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是由肝細(xì)胞大量死亡造成肝功能嚴(yán)重障礙，并在2周內(nèi)出現(xiàn)Ⅱ度以上肝性腦病的臨床綜合征，可出現(xiàn)肝功能異常、黃疸、肝臟生化指標(biāo)異常、凝血功能障礙等， 28 d內(nèi)病死率超過50%[1-2]。其病因多種多樣，藥物(通常是對(duì)乙酰氨基酚)、化學(xué)毒素、病毒感染、酒精、代謝等均可導(dǎo)致ALF，肝切除和肝移植等肝臟手術(shù)后由于肝臟沒有足夠容量來維持肝再生也會(huì)引起ALF[3]。肝移植是治療ALF的有效手段，因此了解肝細(xì)胞再生的病理生理機(jī)制對(duì)于治療ALF有著重大的臨床意義。既往研究[4]發(fā)現(xiàn)，大黃、赤芍可以改善肝衰竭大鼠肝功能，提高大鼠生存率，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)肝細(xì)胞再生相關(guān)。因此，觀察大黃、赤芍注射液對(duì)ALF模型大鼠肝功能及肝再生指標(biāo)的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠120只，鼠齡2個(gè)月，體重190～240 g,由湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK湘2014-0011)。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心完成。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境遵循實(shí)驗(yàn)中心條件，溫度控制在24 ℃左右，光照時(shí)間按照12 h間隔，保持充足飼料和飲水，定期清理排泄物。

1.1.2 大黃注射液：取大黃(購(gòu)自廣西仙茱中藥科技有限公司)粉末1 kg，70%乙醇12倍量，提取2次，每次30 min。抽濾后合并濾液，回收乙醇并濃縮至無醇味，加入95%乙醇至含醇度80%，靜置24 h，抽濾。濾液以20% NaOH調(diào)節(jié)pH至8，冷藏24 h，濾過。濾液以10% HCl調(diào)節(jié)pH至5～6，回收乙醇至無醇味，得到大黃提取物。補(bǔ)加注射用水至100 ml，冷藏24 h，G3過濾后灌封、消毒。

1.1.3 赤芍注射液：取赤芍(購(gòu)自廣西仙茱中藥科技有限公司)粉末1 kg，60%乙醇12倍量，提取30 min。抽濾后合并濾液，回收乙醇并濃縮至2000 ml。加入5%明膠250 ml，充分?jǐn)嚢韬箪o置24 h，抽濾。濾液加入95%乙醇至含醇度70%左右，靜置24 h，抽濾。濾液回收乙醇并濃縮至1000 ml，濃縮液加入95%乙醇至含醇度85%，靜置24 h，抽濾?；厥找掖贾翢o醇味，補(bǔ)加注射用水至1000 ml，冷藏24 h，G3精濾后灌封、消毒。

1.1.4 其他試劑：促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(吉林敖東藥業(yè))，戊巴比妥鈉注射液(北京華業(yè)寰宇化工有限公司)，Jak2(D2E12)XP?兔單克隆抗體(CST)，Phospho-Stat3(Tyr705)(D3A7) XP?兔單克隆抗體(CST)，兔抗-IL-6抗體(博奧森)，兔抗PCNA 抗體(bs-2006R)(博奧森)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與分組：根據(jù)前期研究成果[5]構(gòu)建ALF大鼠模型后，選取100只隨機(jī)分為造模陽(yáng)性對(duì)照組(對(duì)照組)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組(生長(zhǎng)素組)，大黃、赤芍低劑量組(低劑量組)，大黃、赤芍中劑量組(中劑量組)，大黃、赤芍高劑量組(高劑量組)，每組20只。

1.2.2 給藥方法：參照文獻(xiàn)[6]研究方法，以成人用藥劑量為基礎(chǔ)，按照相對(duì)體表面積換算。臨床上大黃、赤芍成人每日給藥量為15 g生藥/60 kg，換算出大鼠對(duì)應(yīng)給藥量為1.46 g生藥/kg，對(duì)應(yīng)注射液靜脈給藥量為每日0.5 ml/100 g。實(shí)驗(yàn)前3 d至結(jié)束分別于尾靜脈注射給藥，1次/d，間隔24 h。低劑量組每日給予0.25 ml/100 g，中劑量組每日給予0.5 ml/100 g，高劑量組每日給予0.75 ml/100 g，對(duì)照組每日給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g，生長(zhǎng)素組參照文獻(xiàn)每日給予促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素1 ml/100 g。實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物均飲用生理葡萄糖鹽水(內(nèi)含10%葡萄糖和0.9%氯化鈉)。

1.2.3 標(biāo)本采集：分別于造模后24、48 h從五組大鼠中隨機(jī)各取6只采集相關(guān)組織樣本。具體操作如下：①大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒后鋪無菌孔巾。正中腹部切開，腹主動(dòng)脈抽取EDTA抗凝血2 ml，3000 r/min離心5 min后收集血清及血漿各1管分裝，-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。②抽血后剖取肝組織并快速放入PBS 中洗凈，濾紙吸干，稱重后10%甲醛液固定，將約100 mg肝組織裝入凍存管放于液氮罐中凍存，約100 mg分裝至RNAlater保存液EP管中，4 ℃冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱。

1.3 觀察指標(biāo) 比較造模后24、48 h各組大鼠血清肝功能指標(biāo)[天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及總膽紅素(TBIL)]及肝再生指標(biāo)[有絲分裂指數(shù)(MI)、增殖指數(shù)(PI)以及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)]。

1.3.1 MI檢測(cè)：將10%甲醛固定的肝組織標(biāo)本進(jìn)行梯度酒精脫水后包埋切片(5 μm)，再次使用常規(guī)酒精脫水、沖洗，進(jìn)行蘇木素和伊紅染色，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察1000個(gè)肝細(xì)胞中有絲分裂細(xì)胞數(shù)目情況。MI=有絲分裂細(xì)胞數(shù)/1000×100%。

1.3.2 PI檢測(cè)：大鼠采血后取下肝組織，剪下約黃豆大小的肝臟放入35 mm培養(yǎng)皿中，加入1640培養(yǎng)基2 ml，在培養(yǎng)皿中將肝臟輕輕研磨成細(xì)胞懸液。用巴氏吸管吸取研磨后的懸液，經(jīng)200目尼龍膜過濾至15 ml離心管中，加1640培養(yǎng)基至10 ml， 2000 r/min離心10 min后棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇10 ml快速混勻，4 ℃過夜。2000 r/min離心10 min后棄上清，加入PBS 10 ml。上述步驟重復(fù)2遍，加入PI/Rnase 500 μl，4 ℃避光孵育30 min后過濾至流式管，上機(jī)收集PI通道熒光數(shù)據(jù)，導(dǎo)出fcs文件，通過modfit擬合分析細(xì)胞在各個(gè)時(shí)期的百分比。

1.3.3 PCNA檢測(cè)：將包埋好的肝組織標(biāo)本切片脫蠟，依次常規(guī)酒精脫水、沖洗，抗原修復(fù)，封閉，孵育一抗，孵育二抗，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片鏡檢，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察染色情況。染色后如果鏡下觀察細(xì)胞核顯棕褐色，則為PCNA陽(yáng)性。隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，總計(jì)觀察1000個(gè)細(xì)胞，記錄PCNA細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 五組大鼠一般情況 五組大鼠在造模4～6 h后蘇醒，表現(xiàn)出精神萎靡、行動(dòng)遲緩、嗜睡等癥狀。12 h內(nèi)只有對(duì)照組中1只大鼠死亡，其他組無死亡大鼠。藥物干預(yù)組大鼠總體表現(xiàn)較對(duì)照組好。中劑量與高劑量組大鼠有腹瀉現(xiàn)象，可能與大黃、赤芍劑量有關(guān)。

2.2 五組大鼠造模后24、48 h血清肝功能指標(biāo)比較 見表1。造模后24 h，對(duì)照組ALT、AST、TBIL水平明顯高于其他四組(均P<0.05)。造模后48 h，五組大鼠各指標(biāo)水平均有所下降，對(duì)照組ALT、AST、TBIL水平仍明顯高于其他四組(均P<0.05)。各藥物干預(yù)組中，以低劑量組與生長(zhǎng)素組肝功能指標(biāo)降低最為明顯，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表1 五組大鼠造模后24、48 h血清肝功能指標(biāo)比較

2.3 五組大鼠造模后24、48 h MI和PI比較 見表2(圖1)。造模后24、48 h，對(duì)照組MI明顯低于其他四組，生長(zhǎng)素組與低劑量組MI明顯高于中、高劑量組(均P<0.05)。造模后24 h對(duì)照組PI低于其他四組，生長(zhǎng)素組與低劑量組PI高于中、高劑量組(均P<0.05)。造模后48 h相比24 h各組PI均有一定提高，對(duì)照組PI仍低于其他四組(均P<0.05)，但其他四組間PI比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

圖1 五組大鼠造模后24、48 h肝組織HE染色結(jié)果(×40)

表2 五組大鼠造模后24、48 h MI和PI比較(%)

2.4 五組大鼠造模后24、48 h PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 見表3(圖2)。造模后24、48 h，低劑量組、高劑量組和生長(zhǎng)素組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組(均P<0.05)。

圖2 五組大鼠造模后24、48 h肝組織免疫組化染色結(jié)果(×40)

表3 五組大鼠造模后24、48 h PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè))

3 討 論

內(nèi)科綜合治療、人工肝支持及肝移植是治療ALF的常規(guī)方法。肝移植手術(shù)為目前終末期肝病治療的唯一有效手段，其通常是在期望立即且充分的肝再生情況下進(jìn)行的[7]。但是，如果沒有發(fā)生肝再生，則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝衰竭和一般情況惡化，從而影響預(yù)后。因此，了解肝再生的生理病理特征對(duì)于疾病的治療轉(zhuǎn)歸和預(yù)后無疑很重要，研究控制肝再生機(jī)制對(duì)于治療肝衰竭、肝切除術(shù)及肝移植手術(shù)有著重大的臨床意義，可有效減輕患者的病死率，提高其生存率及生存質(zhì)量。肝再生可分為三個(gè)階段，即啟動(dòng)期、增殖期和終止期。肝再生是一個(gè)復(fù)雜而精密的過程，與生長(zhǎng)因子、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[8-11]，其中涉及的多種因子及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未明確，也需要醫(yī)療界不斷深入探索、發(fā)現(xiàn)。

大黃具有多種作用，幾乎可作用于肝衰竭發(fā)病的各個(gè)環(huán)節(jié)，是治療肝衰竭的首選藥[12]。當(dāng)代肝病醫(yī)家汪承伯教授重用赤芍治療肝衰竭，也取得了良好療效[13]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)大黃、赤芍注射液能夠上調(diào)肝衰竭大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-6水平，活化JAK/STAT信號(hào)通路，改善肝衰竭大鼠的生存率[14-15]。大黃、赤芍可以提高大鼠肝組織中PCNA水平，促進(jìn)血清中IL-6水平上升，提高術(shù)后大鼠存活率，促進(jìn)肝細(xì)胞再生[4，16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃的主要有效成分為蒽醌衍生物，其治療ALF的主要作用機(jī)制包括增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能、促進(jìn)膽汁排放以及一定的抗感染作用等。赤芍中含有大量單萜苷，赤芍總苷是其主要有效成分[17]。芍藥苷可通過降低肝組織丙二醛、活性氧、一氧化氮、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型)氧化酶4的量及增加谷胱甘肽的量而避免肝氧化損傷[18]。

本研究顯示，對(duì)照組大鼠精神萎靡、行動(dòng)遲緩，藥物干預(yù)組大鼠總體表現(xiàn)較對(duì)照組好。另外，造模后24、48 h，對(duì)照組ALT、AST、TBIL水平明顯高于其他四組；對(duì)照組MI和PI均低于其他四組，生長(zhǎng)素組與低劑量組高于中劑量組與高劑量組；低劑量組、高劑量組和生長(zhǎng)素組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組。這些結(jié)果表明干預(yù)藥物均能夠促進(jìn)肝細(xì)胞活化和增殖，且以低劑量組與生長(zhǎng)素組效果最佳。

綜上所述，大黃、赤芍注射液可有效促進(jìn)肝細(xì)胞增殖再生，提高大鼠存活率，其機(jī)制可能與提高大鼠肝細(xì)胞MI、PI、PCNA水平，促進(jìn)肝細(xì)胞再生有關(guān)。前期研究[19]發(fā)現(xiàn)大黃、赤芍能夠調(diào)控ALF大鼠血清IL-6水平，調(diào)節(jié)活化的JAK/STAT信號(hào)通路，改善肝衰竭大鼠生存率。由于IL-6/JAK/STAT3通路在肝切除術(shù)后對(duì)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)起著關(guān)鍵作用，有助于穩(wěn)定肝再生進(jìn)程，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，而且補(bǔ)償了必要的肝功能[20]。大黃、赤芍是否可以通過IL-6/JAK/STAT通路調(diào)控肝細(xì)胞再生從而提高ALF治愈率，有待進(jìn)一步的研究。