陳淑吟，張志勇，孫瑞健，賈超峰，孟 乾，祝 斐，張志偉，吳國均

( 江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007 )

鈣調磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)，為鈣離子結合蛋白亞家族(CHP)的一個成員[1]，最初是作為腫瘤相關抗原的編碼基因(HCA520)被發(fā)現[2]，其表達水平與癌細胞的增殖關系密切[3]，是參與細胞增殖調控的重要因子[4-5]。研究表明，減少CHP2基因表達或抑制其活性可作為加速細胞死亡的新方法[6]，而對正常細胞增殖影響的研究發(fā)現，CHP2對細胞增殖和遷移的作用可能與細胞是否為癌細胞沒有關系[7]。更多的研究表明，CHP2的一項重要功能是與鈉氫離子交換蛋白(NHE)結合而激活該因子，調控細胞內離子轉運及細胞酸堿平衡[8-10]，進而影響細胞的生長、分裂、增殖、分化和細胞凋亡[11]。CHP2和NHE之間的交互作用，對于保護細胞免受血清剝奪而引起死亡至關重要[5]。而且，CHP2與NHE的親和力是CHP1與NHE的5倍，對NHE的調節(jié)不受血清條件的約束[12]。另外，作為含有結合Ca2+的EF-hand結構蛋白，CHP2在Ca2+吸收及轉運中發(fā)揮重要作用，幾乎參與了從細胞增殖到細胞凋亡各方面的功能調節(jié)[9]。目前CHP2基因在海水經濟魚類中的功能研究報道較少。

黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)，又稱黑棘鯛，屬鱸形目、鯛科、棘鯛屬，是在我國南北沿海均有分布與養(yǎng)殖的優(yōu)質海水魚類。其肉質細膩、味道鮮美又有較好抗逆性。由于生長速度較慢，期望通過選育或雜交培育優(yōu)良新品種是20多年該類鯛魚研究領域的一項重要內容[13-16]。在黑鯛與真鯛(Pagrusmajor)雜交得到的不同雜交后代中，雜交F2(黑鯛♀×真鯛♂)顯示出最好的生長態(tài)勢，而回交F1(黑鯛♂×雜交F1♀)的生長速度甚至慢于黑鯛親本。黑鯛與這些雜交后代在30 d仔魚期的轉錄組數據分析結果顯示，黑鯛中與鈣調磷酸酶相關的一些基因如CHP2、CHP3等的轉錄水平明顯低于雜交子代。鑒于基因表達差異正成為當前雜種優(yōu)勢分子機理研究的新切入點[17]，筆者以轉錄組中的CHP2基因序列為基礎，進行該基因cDNA序列克隆與結構分析，并分析CHP2基因在黑鯛與兩個雜交后代間的表達水平差異情況，為該基因在海水魚類中的功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本與RNA提取

試驗魚樣本均由江蘇海洋水產研究所人工繁育及養(yǎng)殖。黑鯛仔魚用整體樣本；黑鯛、雜交F2(真鯛♂×黑鯛♀)、回交F1(黑鯛♂×雜交子代F1♀)的90、180 d大規(guī)格個體，分別取腦、肌肉、肝臟等組織各約10～15 mg，放入裝有RNA保護劑(QIAGEN)的1.5 mL離心管中按保護劑使用要求操作、保存。每種魚樣本均取3尾魚作為平行。樣本總RNA提取采用Trizol法，并經分光光度計測定質量濃度。

1.2 基因cDNA全長序列擴增

取部分RNA用于反轉錄。cDNA第一鏈的合成使用試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)。以黑鯛轉錄組得到的CHP2基因序列片段為基礎，采用Primer Premier 5.0軟件設計兩條特異引物B-F1/B-R1(表1)。擴增中間片段的PCR反應體系(50 μL)為：PCR-Grade Water 15.0 μL，2×Ex taq Buffer(Takara) 25.0 μL，dNTP Mix(10 mmol/L)1.0 μL，Ex taq(Takara)1.0 μL，cDNA第一鏈5.0 μL，引物B-F1/B-R1(10×)各1.5 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，切膠目的片段并送測序，得到基因中間片段序列。根據獲得的中間序列設計用于擴增5′-RACE 的3條特異性引物B-1(GSP1)、B-2(GSP2)、B-3(GSP3)及3′-RACE的2條特異性引物C-1、C-2(表1)。用試劑盒System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)及SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clotech)，按說明書進行操作，擴增CHP2基因并得出5′及3′cDNA序列。PCR 擴增產物的純化、克隆、測序與中間片段克隆的步驟相同。應用DNAStar Lasergene 7.1軟件，分別組裝CHP2基因的中間片段、5′-RACE片段和3′-RACE片段，獲得全長cDNA序列。

表1 CHP2基因擴增與定量檢測的引物序列Tab.1 The primer sequences of CHP2 gene for amplificationand quantitative detection

1.3 序列分析

基因cDNA的開放閱讀框(ORF)查找使用ORF Finder(http:∥www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)。跨膜區(qū)預測使用TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu. dk/ services/ TMHMM/)。信號肽預測分析采用SignalP(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)[18-19]。蛋白的二級結構、三級結構預測使用SWISS-MODEL服務器(http:∥www. expasy.org/ swissmod/ SWISS- MODEL. html)[20]。分子質量與理論等電點預測采用ExPASy在線服務器的Compute pI/Mw工具(http:∥ www.expasy.org/tools/pi_tool.html)。結構域分析采用NCBI Conserved domains (https:∥www. ncbi. nlm.nih.gov/Structure)。亞細胞定位采用PSORT Ⅱ軟件(http:∥psort.ims.utokyo.ac.jp/ form2. html)。磷酸化位點分析使用NetPhos 3.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。序列相似性搜索采用NCBI網站運行BLAST程序[21]。從GenBank中搜索、下載其他魚類CHP2氨基酸序列，并用ClustalX軟件進行序列同源比對[22]。用MEGA 7軟件以鄰接法及最大似然法構建系統進化樹[23]。

1.4 CHP2 mRNA的不同時期與不同組織的表達差異

以得到的CHP2全長cDNA序列設計合成的特異引物為：F1，CATTTTCGTCCAGCGGACTC；R1，CATCGACCGCAACACCTGAA。內參基因actin引物為：Fa，TATCGTCATGGACTCCGG TG；Ra，TGATGTCACGCACGATTTCC。進行實時熒光定量PCR。通過IO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統，使用試劑Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)測定基因在不同樣本中的表達。熒光定量PCR反應體系為20 μL，以各樣本的cDNA為模板。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，75 ℃ 5 s并采集熒光信號，40個循環(huán)；添加溶解曲線生成程序，95～65 ℃每降0.5 ℃(5 s)采集熒光信號1次。樣品和內參均設3個平行。以溶解曲線分析試驗產物專一性，用2-ΔΔCt法進行初步數據統計分析結果。用SPSS 19.0分析軟件進行數據統計并分析數據的差異性。試驗結果用平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 基因cDNA全長序列與蛋白結構分析

基因中間片段擴增得到長度為479 bp的黑鯛CHP2(AsCHP2)基因序列。以此中間片段設計引物，經RACE得到基因的5′及3′兩端序列，經拼接得到AsCHP2的全長cDNA為1722 bp。分析得出基因具有1個長度為69 bp的5′-非翻譯區(qū)(UTR)和1個長度為1069 bp的3′-UTR，開放閱讀框長度為585 bp，編碼194個氨基酸(圖1)。基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，有加尾信號AATAAA及長度為30 bp的polyA尾巴。

分析得出AsCHP2分子式為C955H1506N274O305S5，分子質量約21.87 ku，理論等電點為4.89；不穩(wěn)定指數為41.39(大于40)，屬不穩(wěn)定蛋白；平均親水系數為-0.559，屬疏水性蛋白；脂肪指數為79.02；不含有信號肽序列，無跨膜結構；為非分泌型蛋白。AsCHP2的亞細胞定位于細胞質中的可能性最大(52.2%)。

AsCHP2結構分析顯示，在氨基酸序列的113～177位之間有2個EF-hand結構域，每個結構各為12個氨基酸，特征序列分別為DQDGDGKISRDE與DADKDDAISFDE(圖1)。基因序列中的EF-hand結構位置見圖2a，8個Ca2+結合位點分別為在第122、124、126、163、165、167位的天冬氨酸(Asp)及第133、174位的谷氨酸(Glu)(圖2b)。此外，AsCHP2序列還含有1個核輸出信號(NES)，氨基酸序列為LQVLRSMLGLQV(圖1)。AsCHP2有6個Serine磷酸化位點。QMEAN同源建模獲得AsCHP2的二級結構見圖3a，其中，H對應α螺旋，S對應β折疊，T對應β轉角，C對應無規(guī)卷曲；圖3b為推測的基因三維結構。

圖1 AsCHP2的全長cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of AsCHP2*為終止密碼子；兩個EF-hand結構和核輸出信號分別用下劃線和黑框標出.*denotes the stop codon; the two EF-hand structures and nuclear output signals are underlined and black boxed, respectively.

圖2 黑鯛AsCHP2基因的EF-hand結構域(a)與鈣結合位點(b)Fig.2 EF-hand domain (a) and calcium binding site (b) of AsCHP2 gene in black porgy

圖3 AsCHP2功能結構域(a)及相應的三維結構預測結果(b)Fig.3 AsCHP2 functional domain (a) and corresponding three-dimensional structure prediction (b)

黑鯛與其他物種CHP2的氨基酸序列比對結果見圖4。其中黑色部分為序列的高度保守區(qū)域，序列完全相同；藍色和粉色部分屬序列相似區(qū)域。由比對結果可知，CHP2的EF-hand及NES等結構域的序列在各物種間高度保守，提示其主要功能在各物種間也應該較為一致。黑鯛與紅樹林鳉(Kryptolebiasmarmoratus)、底鳉(Fundulausheteroclitus)及鯉魚(Cyprinuscarpio)等魚類的CHP2氨基酸序列長度一樣，比人、馬或虎鯨等的少了2～3個氨基酸，均為194個氨基酸，但魚類各自的序列又有不同的變化位點，提示該蛋白可能在結構與蛋白互作上具有一定的種屬特異性。利用BLAST程序比對得出，黑鯛的CHP2氨基酸序列與紅樹林鳉(XP 017281338)、底鳉(XP 012704873)及大黃魚(Pseudosciaenacrocea，XP 019132367)等魚類的相似性為80%～72%。黑鯛的CHP2核苷酸序列與大黃魚(XM 019276822)、大刺鰍(Mastacembelusarmatus，XM 026295996)及小丑魚(Amphiprionocellaris，XM 023296159.1)等魚類的相似性在86%～81%間。

圖4 黑鯛與其他物種的CHP2氨基酸序列同源比對結果Fig.4 Homology alignment comparison of CHP2 amino acid sequence between black porgy and other species黑色.相似性=100%; 粉色.相似性>75%; 藍色.相似性>50%.similarity=100% in black sequence; similarity>75% in pink one; similarity>50% in blue one.

不同魚類的CHP2氨基酸序列鄰接樹聚類結果顯示，黑鯛未先與鱸形目的隆頭魚(Labrusbergylta)及杜氏(Serioladumerili)聚在一起，而是與顎針魚目的青鳉(Oryziasmelastigma)、鳉形目的底鳉和茉莉花鳉(Poecilialatipinna)聚在同一分支，再與紅樹林鳉及鱸形目的杜氏、隆頭魚、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、斑馬宮麗魚(Maylandiazebra)等其他魚類聚為一支(圖5)。

圖5 不同魚類CHP2氨基酸序列的鄰接(a)與最大似然(b)系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of NJ(a) and ML(b) of amino acid sequences of CHP2 in different fishes標尺指進化距離; 節(jié)點上的數值指bootstrap驗證中基于1000次重復的置信度(%).Bar refers to the evolution distance; the value on the node shows the confidence (%) based on 1000 repetitions in bootstrap verification.

同樣，鳉形目也并未單獨聚在一起，如紅樹林鳉與鱸形目的攀鱸(A.testudineus)等聚在一起，成為另一個分支。推測CHP2基因的旁系同源進化發(fā)生在鳉形目和鱸形目的形成之前。不過，鮭形目和鯉形目則聚為另外一個大支，與鳉形目和鱸形目不存在交叉。CHP2基因的鄰接系統聚類樹體現了不同魚類的進化關系。同樣，在最大似然系統樹中也顯示來自不同目的物種混雜聚在一起，而且同為鱸形目的黑鯛、隆頭魚及杜氏均未聚在一支(圖5)，進一步說明CHP2基因早于各個科目的旁系進化特點。

2.2 基因的mRNA差異的表達

定量檢測得知，AsCHP2的mRNA在5～35 d均有表達，其中最高表達量出現在15 d(為5.88)，其次出現在35 d(3.45)，5 d與10 d的表達量變化不大(圖6a)。90 d與180 d個體的AsCHP2基因表達量相比較，前者的肝臟、肌肉及腦各組織的表達量均顯著性高于后者(圖6b)。黑鯛仔魚期的基因表達量相對低于在大個體90 d個體或180 d個體的水平。

圖6 黑鯛CHP2 mRNA基因不同生長階段及組織的表達比較Fig.6 The expression of CHP2 gene mRNA in various tissues at different growth stages in black porgya.不同生長天數仔魚的基因表達情況; b.個體各組織的基因表達情況；試驗結果用平均值±標準誤表示； **.P<0.01; ***.P<0.001.a.the gene expression of larvae with different growth days; b.the gene expression in various tissue; the experimental results are expressed as mean±standard error; **.P<0.01; ***.P<0.001.

同樣在180 d的生長期，AsCHP2 mRNA在黑鯛、回交F1及雜交F2的肝臟、肌肉、心臟、性腺及腦等組織中均有表達，表達水平有組織特異性差異(圖7)?；蛟谛韵俳M織中的表達量均為最低，呈顯著性低于其他組織(P<0.01)；在心臟與肝臟組織中表達量則處于相對高的水平。不同品種相比較，黑鯛的最高表達在心臟(為18.63)，與其他組織相比均有極顯著高表達(P<0.001)，肝臟、肌肉與腦組織間的表達量無明顯差異，性腺中的表達量最低。在雜交F2中，心臟組織的基因表達量也最高(為27.60)，與其他組織及不同魚種的這一組織相比有極顯著性高表達(P<0.001)；肝臟、肌肉、腦及性腺的表達量呈現由高到低的趨勢。在回交F1中，AsCHP2 mRNA在肝臟(12.62)表達量最高，心臟組織為次高表達量(為10.0)，接下來是肌肉、性腺及腦。

圖7 黑鯛、回交F1及雜交F2不同組織的CHP2 mRNA表達差異Fig.7 Differences in CHP2 mRNA expression in different tissues of black porgy, backcross F1 and hybrid F2試驗結果用平均值±標準誤表示; Ns.無顯著差異; **.P<0.01; ***.P<0.001.The experimental results are expressed as mean ± standard error; Ns.no significant different; **.P<0.01; ***.P<0.001.

3 討 論

3.1 AsCHP2基因序列特性與功能結構

作為CHPs蛋白家族3個亞型中的一員，CHP2與其他2個亞型相比有不同的特點。CHP2基因編碼區(qū)長度多為192～196個氨基酸[4]。CHP2與CHP1的氨基酸序列有61%以上的相似性[24]，兩者均有2個可結合Ca2+的EF-hand結構[5]，不過CHP1有NES-1、NES-2兩個核輸出信號序列[25]，CHP2只有一個NES-1序列；而CHP3序列相對較長，卻僅有1個EF-hand結構(即EF3)，無NES序列。本研究結果顯示，AsCHP2基因編碼194個氨基酸，具有2個可以結合Ca2+的EF-hand結構域(EF3、EF4)及1個NES序列，這些特性表明該AsCHP2基因屬典型的CHP2基因。典型的EF-hand構型一般由12個氨基酸殘基構成，包括1(D)，3(D/N)，5(D)，6(G)，8(I)、9(D/S)和12(E)位保守的氨基酸殘基[26]。AsCHP2基因的2個EF-hand序列與經典的EF-hand構型一致，也為12個氨基酸殘基。從哺乳動物到魚類等不同綱目的氨基酸同源比對結果及進化樹的聚類分析結果均反映出CHP2功能結構域序列的高保守性。而基因序列的高保守性多與其功能的重要性密切相關。

作為具有EF-hand結構的Ca2+結合蛋白家族中的特殊成員，Ca2+的存在影響著CHP2以及NHE的結合[27]；攜帶Ca2+能增強CHP2與NHE1的結合能力，在血清饑餓條件下，攜帶Ca2+的CHP2能提升細胞抵抗死亡的能力[1]。CHP2與NHE的結合依賴于CHP2與Ca2+的結合[28]。不同物種在對Ca2+需求條件不同的進化過程，使得CHP2中的EF-hand結構及與Ca2+的結合位點也發(fā)生相應的變異。CHP2實際包含有4個EF-hand結構，不過前2個EF-hand(EF1、EF2)結構屬于原始位點，不能結合Ca2+，后2個EF-hand(EF3、EF4)結構為典型的EF-hand結構，可以結合Ca2+[5,9,24]。張洪菊等[1]研究CHP2中EF-hand結構的生物功能時也發(fā)現，只有EF3、EF4結構突變才會導致CHP2結合Ca2+的功能減弱，并證明在PS120細胞系中CHP2能結合2個Ca2+，結合部位在EF3和EF4結構中。老鼠的CHP2序列中也是這2個EF-hand結構，也只有2個Ca2+結合位點[9,29]。而在AsCHP2基因的EF3、EF4結構中，卻各有4個Ca2+結合位點。這是否與魚類所處環(huán)境及對Ca2+需求與結合能力差異相關，或是不同種屬間的基因變異的結果，有待于進一步探索。不過，黑鯛的另一個EF-hand基因家族的鈣調蛋白(CaM)中有4個EF-hand結構，每個EF-hand結構中也是各有4個Ca2+結合[30]，并且該CaM氨基酸序列與大黃魚的相似性達到99%，顯示了CaM序列在進化上比CHP2更保守。

CHP2的NES結構一般位于序列第137～148位氨基酸之間，由12個氨基酸構成[5，11]。AsCHP2的NES序列同樣為12個氨基酸，只是其位于序列第135～146位氨基酸之間。CHP2的NES結構可調控蛋白獨特的亞細胞分布，對蛋白的亞細胞定位至關重要。錢曉萍等[31]研究得知，CHP2不同亞細胞定位對海拉細胞增殖調控具有差異性，CHP2定位于核內將顯著地促進海拉細胞的增殖和成瘤能力。

3.2 CHP2基因表達差異分析

CHP2對細胞生物學行為影響的差異可能與其在細胞內的表達量有關，表達量的差異導致了CHP2對NHEs的調節(jié)方式發(fā)生改變[32]。研究表明，CHP2是抑制細胞死亡的“因子”之一[6]。本研究中，AsCHP2 mRNA在黑鯛的仔魚期及90、180 d個體的不同組織中均有表達，可見該基因參與了黑鯛的生長發(fā)育過程；而且，90 d個體不同組織的表達量均顯著性高于180 d個體的，黑鯛的第90天生長期處于池塘水溫較高的夏季，此時個體生長速度明顯快于第180天的秋冬季。而且，除了性腺組織外，CHP2基因在生長快速的雜交F2個體其他各組織中的表達量，均高于在生長速度相對慢的回交F1個體?；虻母弑磉_為雜種優(yōu)勢的體現[17]。本研究中的3種魚不同組織中均檢測到CHP2基因的表達，可見在這些海洋魚類中，該基因在正常生長過程中發(fā)揮作用；而在一些哺乳動物中，CHP2基因多在腫瘤組織中有異常的高表達[24,32-33]，或只少量表達于小腸、腎臟等組織中[24,29,31]。不過，本研究中CHP2基因表達有組織特異性，這一結果與在昆明鼠[34]中的表現一致。最近的研究得出，CHP2基因表達的降低可有效抑制人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)的增殖，CHP2基因的敲降也抑制了HUVEC細胞的遷移，明確了基因表達的多少與是否為正常組織無關[7]。目前對CHP2基因功能的了解仍較少，本研究的這些結果說明了CHP2基因在魚類的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

4 結 論

綜上所述，AsCHP2基因為典型的CHP2基因，其在早期仔魚及成體的腦、肝臟及肌肉等組織中均有表達；CHP2基因表達量與種類及生長階段相關，且均高表達于心臟、低表達于性腺組織。CHP2基因在海水魚類的生長過程中發(fā)揮作用。