竇 勇，吳 琳，閆永芳，任虹燁，陳家宇，喬之怡，翟勝利，周文禮

( 1.天津農學院 水產學院，天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384； 2.天津現(xiàn)代晨輝科技集團，天津 301802 )

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細胞微藻，在分類學上屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬[1]。其生活史主要分為游動細胞階段和不動細胞階段。在外界環(huán)境條件適宜時，微藻以游動狀態(tài)存在，依靠兩條頂生、等長的鞭毛運動，這一階段的細胞大多呈綠色，此時微藻生長旺盛，生物量積累迅速[2]。當雨生紅球藻處于高光照度、高鹽度及營養(yǎng)缺乏的脅迫條件時，細胞以紅色厚壁孢子形式存在，此階段細胞鞭毛脫落，運動能力喪失，開始逐漸合成并積累蝦青素[3]。

蝦青素是一種脂溶性的次級類胡蘿卜素，屬于萜烯類的不飽和化合物[4]。蝦青素是目前為止在自然界有機體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強的物質，它清除自由基和單線態(tài)氧淬滅的能力遠遠高于維生素E，比玉米黃質、番茄紅素及β胡蘿卜素等常見抗氧化物質的抗氧化能力高10倍以上，此外蝦青素還具有抑制腫瘤、提高免疫力的作用，目前被用作保健品輔料和食品添加劑[5-7]。蝦青素還有良好的著色效果，可以進入生物體并貯存在組織中，農業(yè)部2003年[318]號公告中指定天然蝦青素為水產動物唯一著色劑[8-9]。雨生紅球藻細胞內的蝦青素含量占細胞干質量的1.5%～4.0%，而且全部是高生物活性的3S，3′S形態(tài)，因此被公認為是自然界中生產天然蝦青素的最佳“生物反應器”[10]。深入了解雨生紅球藻合成、積累蝦青素的分子基礎，探索人工誘導雨生紅球藻合成蝦青素的技術手段，對于利用雨生紅球藻這一“生物反應器”生產天然蝦青素具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 雨生紅球藻積累蝦青素的分子基礎

雨生紅球藻在脅迫作用下合成蝦青素的生物化學途徑雖已得到充分認識，但該過程同時伴隨著細胞形態(tài)和結構轉變以及生理生化、遺傳網絡、代謝通路層面的變化，而且這些變化穿插發(fā)生在細胞質、葉綠體、內質網及細胞核等亞細胞結構中，并受到基因表達、轉錄調控、翻譯后修飾等不同層次的調節(jié)[11-14]。有文獻指出，通過蝦青素關鍵酶基因的轉錄和翻譯水平的調控及酶蛋白翻譯后的活性調控是實現(xiàn)雨生紅球藻蝦青素誘導合成的主要機制[15]。由此看來，雨生紅球藻合成蝦青素的生理代謝過程是極其復雜的，許多研究人員對此進行了深入研究，逐漸對該過程的代謝、遺傳調控網絡有了較為清晰的認識，但其中還有許多問題目前仍無法清晰解釋[16-20]。

1.1 與雨生紅球藻積累蝦青素相關的基因、調控元件與轉錄因子

1.1.1 雨生紅球藻全基因組分析

有機體的所有生命活動均可以從基因中得到答案，因此高質量的生物全基因組數(shù)據(jù)是探索有機體生命活動規(guī)律最重要的資料。深圳大學的科研團隊[21]首次完成了雨生紅球藻全基因組測序、組裝和注釋工作，生成了一份669.0 Mb規(guī)模的基因組草圖(scaffold N50為288.6 kb)，并預測了18 545個基因。研究者還從14個代表性藻類中建立了穩(wěn)健的系統(tǒng)發(fā)育樹種類，并借助轉錄組數(shù)據(jù)揭示了雨生紅球藻中一些涉及合成、積累和調節(jié)蝦青素生產的新型潛在基因，還在此基礎上產生了高可信度的包含18 483個轉錄本的同工型水平參考轉錄組，并通過選擇性剪接分析證實內含子保留是最普遍的模式，該基因組以及轉錄組數(shù)據(jù)為理論研究和商業(yè)生產提供了可靠的基礎資料。

1.1.2 雨生紅球藻積累蝦青素相關的調控元件和轉錄因子

全基因組數(shù)據(jù)為厘清雨生紅球藻合成蝦青素的調控網絡提供了最基礎的資料，而對基因組精細結構的解析為詳細描摹該過程提供了更多的細節(jié)信息，該方面的工作主要集中于對關鍵酶基因非編碼DNA序列(如啟動子、增強子)等順式作用元件和轉錄因子等反式作用元件的研究。Wei等[22]利用凝膠阻滯的方法研究了雨生紅球藻中bkt基因309 bp啟動子區(qū)域的轉錄因子結合位點，并發(fā)現(xiàn)了特異性的核蛋白結合位點，進一步的分析證實該位點區(qū)域存在響應環(huán)境脅迫因子、對香豆酸及激素反應的G-box。孟春曉[23]借助基因組上游步移技術克隆了雨生紅球藻bkt基因兩個不同的5′上游側翼序列，發(fā)現(xiàn)其類似于高等植物脅迫誘導基因中的順式作用元件；定點突變結果發(fā)現(xiàn)，APE-like(藍光調控元件)對于bkt基因自身的轉錄可能存在影響。進一步分別針對這兩個不同的5′上游側翼序列構建了一系列缺失突變體，驗證了其中可能包含的增強子區(qū)或抑制子區(qū)，同時證明了1.5 kb大小的5′上游側翼序列對應ATG下游的第一個內含子可能是控制bkt基因轉錄的抑制子。Gao等[24]克隆了雨生紅球藻中crtO基因的3個不同大小的5′上游側翼序列(1.1、1.9 kb和2.2 kb)，并利用生物信息學方法分別預測并比較了這3段序列，結果發(fā)現(xiàn)三者具有與高等植物相類似的順式作用元件，如脫落酸反應元件(ABRE)、干燥或低溫反應元件(DRE/C-repeat)、幾種光反應元件(G1-box，GAG-motif，l-boxand ATC-motif)、熱激反應元件(HSE)、機械傷害反應元件(WUN-motif)、生長素反應元件(TGA-element)、茉莉酸甲酯反應元件(TGACG-element)和反式作用因子MYB蛋白的結合位點(MBS和MRE)等，但三者均不具有典型的TATA和CCAAT框，結果預示了雨生紅球藻蝦青素合成過程中crtO基因調控方式的多樣化。寧晶晶[25]通過對小RNA轉錄組數(shù)據(jù)和mRNA轉錄組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，研究了雨生紅球藻蝦青素合成中的miRNA-TF共調控網絡，發(fā)現(xiàn)4個miRNA和9個轉錄因子參與了微藻細胞內的蝦青素和油脂合成調控，并進一步證實蝦青素和油脂合成途徑的酶基因既受轉錄因子的正調控，也受miRNA的負調控，參與兩個途徑的轉錄因子和miRNA既有相對獨立性，還存在著一定的交互作用。脅迫條件下雨生紅球藻積累蝦青素的過程十分復雜，除了代謝途徑和遺傳網絡方面的改變，表觀遺傳學層面的變化也起了重要作用。張克亞等[26]對缺氮脅迫0、24、72 h的雨生紅球藻基因組DNA進行甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析，共得到了291個甲基化多態(tài)性位點，并發(fā)現(xiàn)基因組甲基化率伴隨蝦青素合成發(fā)生顯著變化，這表明DNA甲基化調節(jié)方式的改變是蝦青素積累過程中的一種重要調控模式。

1.2 與雨生紅球藻積累蝦青素相關的重要蛋白質

根據(jù)中心法則，有機體生命活動的最終體現(xiàn)者是基因的表達產物——蛋白質，因此對生命過程中關鍵蛋白質的解析是探求生命活動規(guī)律的重要方法。光是環(huán)境中重要的信號因子，對真核微藻的生長發(fā)育具有重要的調控作用，光不僅提供光合作用所需要的能量，自身也蘊含光質、光強和光周期等信息[27]。真核微藻通過光受體感知光照信號，并通過信號轉導系統(tǒng)調控多種生理過程，包括形態(tài)建成、生物節(jié)律、趨光性以及次級代謝產物合成與積累等。有學者利用同源克隆和RACE技術結合的方法獲得了藍光受體向光素PHOT的cDNA全長，并借助生物信息學工具進行了其理化性質、蛋白結構和系統(tǒng)進化方面的分析研究[28-29]。近年來研究人員開發(fā)出一系列光遺傳學元件，通過光敏蛋白響應特定波長的光，經過一系列構象改變、蛋白間可逆結合以及聚合反應，驅動特異性生理反應，包括(去)激活特異性蛋白活動、激活或抑制轉錄、亞細胞定位、局部活性氧生產和其他功能，為研究雨生紅球藻的光響應生理及機制提供了潛在的工具[30]。顧文輝[31]通過比較雨生紅球藻和鹽藻強光響應下類囊體膜蛋白組的變化，發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻對強光脅迫的適應性更強，并推測雨生紅球藻可能在適應強光的過程中重新調整了碳流向，并通過多種機制參與光保護以及蝦青素的生物合成。范勇等[32]通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻的質體內確實存在質體球滴結構——plastoglobules，并通過RT-PCR結合RACE技術，從雨生紅球藻cDNA文庫中克隆到與編碼plastoglobules的結構蛋白Plastoglobulin具有高度同源性的Hpgp基因序列全長，并進一步利用原核表達系統(tǒng)將該編碼基因進行原核誘導表達，然后用His-Tag蛋白分離純化得到了目標蛋白。王坤鵬[33]對脅迫早期的雨生紅球藻進行轉錄組測序，并對高響應強光和醋酸鈉脅迫的HpGNAT-1基因進行分子克隆及生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框長度為493 bp，同源性分析表明，HpGNAT-1基因的表達產物可能為N-乙酰基轉移酶，該基因可翻譯成含163個氨基酸且可能定位于細胞質的蛋白，并推測該蛋白可能存在4個α-螺旋和7個β-折疊，具有N-乙?；D移酶家族保守結構域和Rim Ⅰ結構域等結構，并可能通過與輔酶A結合作用于核糖體蛋白S18亞基對轉錄進行調控。

類泛素化蛋白修飾分子(SUMO)化修飾是一種蛋白翻譯后的修飾方式，其在蛋白質之間相互作用、蛋白質在細胞內的定位、轉錄因子活性等方面發(fā)揮多種調節(jié)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子LBD30通過SIZ1介導的類泛素化蛋白修飾分子化修飾作用于擬南芥纖維細胞次生細胞壁加厚過程，證實LBD30的類泛素化蛋白修飾分子化修飾直接對纖維細胞壁加厚的轉錄程序進行調控，類泛素化蛋白修飾分子化的LBD30促進細胞壁加厚的轉錄程序啟動[34]。該研究首次發(fā)現(xiàn)了蛋白質類泛素化蛋白修飾分子化修飾在調控次生細胞壁形成中的重要功能，揭示了次生細胞壁形成多層次調控網絡的一個新途徑。雖然是以高等植物擬南芥為材料，但是該信號通路具有較高的跨物種保守性，因此為解釋雨生紅球藻響應環(huán)境脅迫時細胞壁加厚的生理過程提供了線索和方向。

2 雨生紅球藻積累蝦青素的人工誘導調控研究

發(fā)生在雨生紅球藻細胞內的蝦青素生物合成途徑雖然已經得到充分認識，但是該途徑的自然合成效率以及底物、能源的利用率均很低，是制約蝦青素規(guī)?；a和商業(yè)化應用的“瓶頸”問題，因此培養(yǎng)環(huán)境脅迫因子調控、通過物理和化學手段進行人工誘變育種、無機和有機碳源加富以及外源刺激物誘導成為提高雨生紅球藻生產蝦青素能力的常用方法[35-37]。

2.1 培養(yǎng)環(huán)境調控對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.1.1 光照對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

光照是微藻生命活動不可缺少的環(huán)境因子，對光照條件進行有效控制可以促進雨生紅球藻合成、積累蝦青素。有研究證實，不同光質對雨生紅球藻的誘導效果不同[38]，紅光有利于雨生紅球藻生長，藍光有助于雨生紅球藻積累蝦青素，此外連續(xù)光照較光暗交替更利于蝦青素積累[7]。江紅霞等[39]研究了不同光強和光周期對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，發(fā)現(xiàn)微藻細胞內的蝦青素含量隨光強上升而提高，在270 μmol/(m2·s)的光強條件下連續(xù)照射10 d雨生紅球藻內的蝦青素水平和抗氧化能力最高。Ma等[40]使用150 μmol/(m2·s)的白光LED和70 μmol/(m2·s)的藍光LED對雨生紅球藻進行脅迫，結果表明，兩種光照條件下微藻細胞內的蝦青素和總脂肪酸含量顯著上升，與色素合成及脂質積累相關的基因psy、crtO、bkt2、lcy、crtR-B、fata和dgat表達量明顯上調。

2.1.2 鹽度對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

有研究表明，高鹽度脅迫是刺激雨生紅球藻積累蝦青素的有效手段[41-43]。黃水英等[44]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不大于10 g/L的NaCl可以顯著促進雨生紅球藻合成并積累蝦青素。Boussiba等[45]證實，將雨生紅球藻培養(yǎng)基中的NaCl含量提高3倍時，微藻細胞內蝦青素水平較原來提升了121%。江紅霞等[46]發(fā)現(xiàn)，使用0.12 mol/L的NaCl處理雨生紅球藻，可以使其細胞內的蝦青素含量、非特異性免疫活力以及與蝦青素合成相關的lcy、crtR-B和bkt基因表達量顯著提高，證實了雨生紅球藻在高鹽脅迫下主要是通過提高蝦青素合成相關酶基因的轉錄水平來促進蝦青素合成，并與非特異性免疫系統(tǒng)中的抗氧化酶互相協(xié)作，降低細胞遭受高鹽脅迫引起的損傷。雖然高鹽度會促進雨生紅球藻積累蝦青素，但是鹽度過高會影響微藻正常的生命活動，因此在實際操作中需要在雨生紅球藻生長和蝦青素積累之間權衡選擇合適的處理鹽度。

2.1.3 營養(yǎng)因素對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

營養(yǎng)缺乏作為環(huán)境脅迫因子，可以誘導雨生紅球藻合成與積累蝦青素，而缺素培養(yǎng)在天然蝦青素生產過程中也具有重要的現(xiàn)實意義。楊瑾等[47]發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻CG-06株細胞內的色素積累量和積累速率均與初始硝態(tài)氮含量呈反比，缺氮條件下雨生紅球藻CG-06積累蝦青素的峰值時間較對照組提前6 d，峰值水平較對照組提高0.78 μg/mg。莊惠如等[48]將BBM培養(yǎng)基中的氮源NaNO3質量濃度減半時(0.13 g/L)，發(fā)現(xiàn)對雨生紅球藻細胞增殖和蝦青素累積均有利，在高光強下進一步進行氮、磷饑餓脅迫時，微藻細胞分裂明顯受到抑制，但細胞內蝦青素含量分別較對照組提高141.0%和60.5%，色素累積高峰也提前2～4 d，顯示了營養(yǎng)虧缺對蝦青素合成與積累的促進作用。雖然營養(yǎng)虧缺有利于雨生紅球藻積累蝦青素，但有學者證實，當培養(yǎng)體系中同時缺少磷、鎂和鐵元素時，雨生紅球藻細胞光化學效率下降，光系統(tǒng)能量分配發(fā)生改變，生長受到抑制[49]。由此看來，不同元素在雨生紅球藻生命活動中的作用不同，缺氮培養(yǎng)是誘導雨生紅球藻積累蝦青素的適宜途徑，而磷與金屬元素在雨生紅球藻培養(yǎng)中是不可缺少的。

2.1.4 雨生紅球藻積累蝦青素的培養(yǎng)工藝優(yōu)化

培養(yǎng)條件下影響雨生紅球藻積累蝦青素的環(huán)境因子很多，許多學者對雨生紅球藻的培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化，旨在確定最有利于蝦青素積累的培養(yǎng)條件組合。李嘉儀等[50]研究了光照強度、NaNO3濃度和NaCl濃度對雨生紅球藻積累蝦青素的作用，發(fā)現(xiàn)脅迫因子的影響能力為NaCl濃度>光照強度>NaNO3濃度，并利用響應面法優(yōu)化得到積累蝦青素的最佳條件，此時蝦青素產量為6.8 mg/L。Su等[51]評估了乙酸鹽、Fe2+和強光3種脅迫條件的各種組合對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，并基于GC-MS的代謝組測定和加權基因共表達網絡分析(WGCNA)構建了代謝網絡，為人工誘導雨生紅球藻合成與積累蝦青素提供了一定的數(shù)據(jù)支持。陶云瑩[52]研究了多種環(huán)境因子對雨生紅球藻生長、蝦青素及內源激素積累的影響，結果表明，“23 ℃+200 μmol/(m2·s)”的培養(yǎng)條件最適合雨生紅球藻生長，而“27 ℃+200 μmol/(m2·s)”最適合蝦青素和內源脫落酸合成，此外酸堿脅迫都能促進雨生紅球藻中脫落酸的積累，但是弱堿性環(huán)境適合微藻生長，而堿性環(huán)境適合蝦青素的積累。Wan等[53]創(chuàng)造性地提出了“異養(yǎng)—稀釋—光誘導”的串聯(lián)培養(yǎng)模式，首先通過異養(yǎng)培養(yǎng)提高雨生紅球藻細胞密度，然后稀釋至合適密度并切換至微藻適應的環(huán)境，最后使用高光照誘導微藻積累蝦青素，通過此種策略每升培養(yǎng)液中的雨生紅球藻細胞干質量可以達26 g，在異養(yǎng)期微藻生產力高達64.1 mg/(L·h)，此時微藻細胞內的蝦青素可達細胞干質量的4.6%。

2.2 人工誘變對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.2.1 物理誘變因素對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

在實際操作中常用高能射線、激光、紫外線和低溫等離子體對雨生紅球藻基礎藻株進行誘變育種，以獲得高積累蝦青素和油脂等次級代謝產物的優(yōu)勢藻株。李珂[54]使用60Co-γ射線核誘變顯著提高了雨生紅球藻的生長固碳速率和蝦青素含量，突變藻株的生長速率較野生株提高了28.6%，而蝦青素質量濃度和油脂質量分數(shù)分別由19.5 mg/L和36.1%提高至46.0 mg/L和45.9%。劉京華[55]采用大氣壓介質阻擋放電(DBD)對雨生紅球藻進行誘變以獲得髙產蝦青素的突變藻株，并建立了基于紅外和拉曼顯微光譜成像技術的高產蝦青素突變藻株快檢方法，能夠在微觀尺度上對蝦青素等次級代謝產物進行快速定量分析。田燕[56]采用Nd：YAP激光為誘變劑，獲得了生長速度快、抗逆性強、目標產物含量高的優(yōu)良雨生紅球藻藻株。劉峰[57]采用紫外線誘變的方法，獲得了兩株生物量和蝦青素含量均較高的突變藻株，與出發(fā)藻株比，突變株的生長速度與蝦青素含量提高了4.5%～18.9%。Chen等[58]使用低溫等離子體處理得到高積累蝦青素的雨生紅球藻突變株M3，M3具備更高的CO2同化率，而qRT-PCR結果顯示，M3通過調節(jié)葉綠體呼吸途徑和提高非光合色素(葉黃素、β胡蘿卜素和蝦青素)含量有效地緩解了光氧化損傷。韓國研究人員使用100 mA(25 V電壓)的電流對培養(yǎng)瓶中的雨生紅球藻進行持續(xù)刺激，發(fā)現(xiàn)處理組的微藻細胞密度較對照組提高1.2倍，蝦青素產量提高10%，最高可達32.6 mg/L[59]。

2.2.2 化學誘變因素對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

化學誘變相比于物理誘變，能耗和成本較低，是改善微藻品系經濟性狀的理想手段，常用的誘變劑有烷化劑和疊氮化物等。沈國明等[60]用不同質量濃度的烷化劑——亞硝基胍對雨生紅球藻進行處理，發(fā)現(xiàn)2.5 g/L的亞硝基胍誘導下，雨生紅球藻的增長速率和細胞內積累的蝦青素質量濃度最高，分別為(0.381±0.0289) mg/L和(2.9±0.29) mg/L，而3.5 g/L的亞硝基胍會嚴重影響雨生紅球藻的葉綠素合成，造成藻體脫色，由此可見選擇適宜的質量濃度是進行化學誘變的關鍵步驟。孫延紅[61]用甲基磺酸乙酯和疊氮鈉對雨生紅球藻進行誘變，發(fā)現(xiàn)經0.02%甲基磺酸乙酯誘變10 d后，分離得到的誘變株的蝦青素水平較出發(fā)株提高40%，而經200 mg/L 疊氮鈉誘變24 h后，分離得到的誘變株的生物總量較出發(fā)株提高43%，而蝦青素產量未顯著提升，這說明不同的誘變劑可能具有不同的作用機制，其對雨生紅球藻的影響也表現(xiàn)出明顯的差異。

2.3 外加CO2或其他有機碳源物質對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.3.1 外加CO2對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

雨生紅球藻除了可以進行光合自養(yǎng)生長之外，還能在外加CO2的條件下提高光合速率和能量生產，從而加快生物量和次級代謝產物積累。Cheng等[62]在雨生紅球藻培養(yǎng)體系中外加不同質量分數(shù)的CO2處理，發(fā)現(xiàn)在添加6% CO2的條件下，雨生紅球藻的生物量和積累蝦青素的水平最高。Christian等[63]在雨生紅球藻紅色細胞階段將CO2質量分數(shù)提高至5%和15%，改變了培養(yǎng)體系的C、N平衡，此時雨生紅球藻積累了較對照組高2～3倍的蝦青素。李珂[54]發(fā)現(xiàn)用質量分數(shù)15% CO2誘導時，雨生紅球藻代謝通路中的碳固定、糖酵解、丙酮酸代謝、脂肪酸和類胡蘿卜素合成途徑比空氣條件下明顯增強，與油脂代謝和蝦青素合成相關的酶表達量上調2.9～18.4倍，而最終收獲的蝦青素和油脂含量分別達到細胞干質量的3.6%和31.8%。以上研究結果反映了不同雨生紅球藻株對CO2耐受性的差異，也提示研究者在實際操作中要根據(jù)研究對象自身生理特性的差異選擇適宜的CO2添加水平。

2.3.2 外加其他有機碳源物質對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

雨生紅球藻在外源有機碳源存在的情況下可以進行異養(yǎng)生活，提高自身生物量和產物積累，因此添加外源碳源是促進雨生紅球藻生長和積累蝦青素的有效手段。陳俊琳[64]以乙酸鈉和丙酮酸鈉作為外加碳源，并設計不同的添加策略，結果表明，同時添加兩種碳源時，雨生紅球藻細胞內蝦青素質量濃度為10.836 mg/L，而首先添加丙酮酸鈉作為轉化碳源，轉化8 d后更換乙酸鈉為轉化碳源時，雨生紅球藻蝦青素質量濃度為10.887 mg/L。有研究表明，添加外源葡萄糖有助于促進雨生紅球藻生長和積累蝦青素，同時還可以提高微藻細胞中內源激素如脫落酸、赤霉素和吲哚乙酸的合成[52]。

2.4 外源刺激物質對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.4.1 外源有機物對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

使用小分子有機物作為外源刺激物質對雨生紅球藻進行誘導，進而改變微藻的代謝途徑以促進目標產物合成，是獲得蝦青素和脂質等次級代謝產物的常用手段。尚敏敏等[65]研究證實，添加外源黃腐酸可以顯著影響雨生紅球藻生長和蝦青素積累；當黃腐酸質量濃度為5 mg/L，藻細胞生物量達到了79.39 mg/(L·d)，蝦青素質量濃度達20.82 mg/L，分別較對照提高4.25%和86.89%；當黃腐酸質量濃度為10 mg/L，藻細胞的生物量產率和蝦青素產量分別較對照提高5.44%和9.78%。岳陳陳等[66]發(fā)現(xiàn)，在高光照度和缺氮脅迫條件下，外源添加10 μmol/L褪黑素可有效提高雨生紅球藻LUGU中蝦青素的含量，最高可達31.32 mg/g，是對照組的2.36倍，同時細胞內的活性氧水平受到抑制，而信號分子一氧化氮和水楊酸含量顯著上調，此外dxs基因表達水平較對照組明顯提高，說明在非生物脅迫條件下，雨生紅球藻中蝦青素的大量積累可能與外源褪黑素調控細胞內活性氧、信號分子及基因表達有關。Ding等[67]發(fā)現(xiàn)，叔丁基羥基茴香醚處理可以使雨生紅球藻細胞內的蝦青素的含量較對照提高2.17倍，脂質含量提高1.22倍，叔丁基羥基茴香醚處理可同時降低微藻碳水化合物和蛋白質合成，并延遲葉綠素降解；后續(xù)的代謝組學分析表明，叔丁基羥基茴香醚上調并激活了涉及細胞基礎代謝和信號傳導系統(tǒng)的生物過程(如糖酵解、三羧酸循環(huán)，氨基酸代謝和磷脂酰肌醇信號傳導系統(tǒng))，從而增強了微藻的蝦青素和脂質積累能力。Liu等[68]發(fā)現(xiàn)，0.4%的乙醇通過誘導雨生紅球藻的茉莉酸甲酯通路，引發(fā)微藻細胞壁結構和生理屬性改變，同時顯著提高細胞內蝦青素積累，進一步的研究證實蝦青素的積累抵消了乙醇誘導產生的氧化脅迫。Lu等[69]用外源植物激素甲基茉莉酮酸酯和赤霉素處理雨生紅球WB-1藻株，發(fā)現(xiàn)微藻細胞內蝦青素水平顯著提高；通過分子生物學手段在bkt1基因的5′側翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了典型的赤霉素A3響應順式元件；結果表明，雨生紅球藻合成蝦青素的過程可能受到內、外源激素的調控。

2.4.2 外源無機物對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

近年來的研究表明，一些無機小分子可以作為雨生紅球藻合成蝦青素的誘導因子，起到顯著促進雨生紅球藻積累蝦青素的作用。有研究表明，F(xiàn)e2+和二鹽酸鹽可以分別為蝦青素合成提供氧化誘導劑HO·和AO2·，從而提高雨生紅球藻積累蝦青素的水平[70]。于馨恒[71]發(fā)現(xiàn)，H2O2和Mg2+處理可以顯著提高雨生紅球藻的生物量和蝦青素積累。Li等[72]證實，3.0 mmol/L的Na2WO4是促進雨生紅球藻積累青蝦素的最適濃度，此時微藻細胞內的蝦青素含量為(49.41±0.13) pg/細胞，而與蝦青素合成相關的ipi、psy和bkt基因表達量也顯著提高。外源無機小分子物質大多是雨生紅球藻氧化應激反應的誘導劑，它們在觸發(fā)雨生紅球藻抗逆反應的同時促進其合成和積累蝦青素，抵御氧化脅迫對細胞的傷害。

3 展 望

目前雖然已經掌握了關于雨生紅球藻細胞內蝦青素生物合成與積累的大量信息，但仍有許多具體問題處于探索階段。如對蝦青素生物合成過程中所推測的某些中間代謝物仍未完全分離和測定；對蝦青素生物合成途徑中相關酶的表達調控網絡的識別尚未達到足夠的分辨率，脅迫誘導引發(fā)的信號傳導通路、級聯(lián)傳遞途徑和信號轉導組分還沒有完全判明。

活性氧和質體末端氧化酶參與蝦青素合成的誘導調控通路的直接證據(jù)目前仍然缺乏。蝦青素生物合成與光合作用之間的關系一直是研究人員關注的熱點，但是蝦青素與光系統(tǒng)以及光合電子傳遞鏈各組分之間的相互作用，至今仍未得到完全解析。另外，對那些發(fā)生在蝦青素大量積累和其他類胡蘿卜素合成之前的早期事件了解甚少，而且對該過程中參與調控的轉錄因子研究也相對薄弱。

針對以上問題，近年來在微藻研究領域得到較好應用的多組學meta分析和“轉錄因子工程”分析技術為克服以往的困難提供了強有力的武器，而高性能計算技術的發(fā)展也為詳細破解雨生紅球藻細胞內的蝦青素代謝網絡帶來了希望。而另外一個值得關注的方向就是通過基因工程手段將微藻細胞內涉及蝦青素生物合成途徑中的關鍵限速酶基因進行克隆和人工改造，然后借助轉基因技術構建具有高積累蝦青素能力的高等植物植株，該領域雖然已經取得了一定進展，但是轉基因植株的生物安全性問題目前仍然處于爭議之中。