陳麗佳，張巖

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津 300052）

鼻咽癌（NPC）是源于鼻咽上皮組織的惡性腫瘤，大多數(shù)為非角化性未分化癌，極易侵犯周邊組織并經(jīng)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。NPC在歐洲、北美地區(qū)發(fā)病率較低，而高發(fā)于東南亞及中國南部，其中廣東、廣西等地區(qū)約占總發(fā)病例數(shù)的80%[1]。由于鼻咽癌發(fā)生的解剖學(xué)部位具有特殊性以及早期的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移使手術(shù)切除難以進(jìn)行，目前鼻咽癌的治療以放療為主并輔以化療。鼻咽癌放療后常出現(xiàn)頭頸部器官組織放射性損傷，常規(guī)化療藥物環(huán)磷酰胺、順鉑、5-氟尿嘧啶等可導(dǎo)致多種嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]。因此，尋找安全有效治療藥物是臨床急需解決的問題。天然植物的抗腫瘤活性化合物具有低毒高效的特點，現(xiàn)有多種中藥材的提取物制備成現(xiàn)代藥物制劑在臨床上廣泛使用[3]。消癌平注射液是療效顯著的抗腫瘤輔助藥物之一，由蘿藦科植物通關(guān)藤的提取物制備而成，適應(yīng)癥主要為食道癌、胃癌、肝癌[4]。研究表明甾體皂苷類化合物是通關(guān)藤的抗腫瘤活性成分之一，其中通關(guān)藤苷H可通過影響PI3K/Akt信號通路抑制消化系統(tǒng)腫瘤的生長和增殖[5-6]。目前，國內(nèi)外未見有通關(guān)藤苷H在鼻咽癌方面的藥效和藥理研究報道，因此文章嘗試以低分化CNE-2鼻咽癌細(xì)胞作為疾病模型，研究通關(guān)藤苷H對其增殖和侵襲的抑制作用，為闡明消癌平注射液的藥理機(jī)制和擴(kuò)大其適應(yīng)癥提供臨床前的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 通關(guān)藤苷H（美國Sigma Aldrich公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo化工研究所）。RPMI1640培養(yǎng)基、特級胎牛血清、0.25%胰酶溶液（美國 Gibco公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）、AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2和MMP-9）酶聯(lián)免疫疫吸附（Elisa）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），膠原包被Transwell培養(yǎng)板（美國Corning公司），β 肌動蛋白（β-actin）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-GSK-3β）、周期蛋白-D1（Cyclin D1）、上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)性鈣黏附蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等兔抗人一抗以及羊抗兔二抗均購于（美國Abcam公司）。

1.2 儀器 CellXpert C170i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司），ALLEGRA X-15R臺式離心機(jī)（美國Beckman公司），F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司），Western blot轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-rad公司），DMi8倒置顯微鏡（德國Leica公司），Statfax 4200酶標(biāo)儀（美國Awareness公司）。

1.3 細(xì)胞 人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將CNE-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS），100 mg/L青霉素，100 mg/L硫酸鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度、5%二氧化碳（CO2）、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長覆蓋約至80%時，用0.25%胰酶消化傳代，并按3×104cells/mL密度接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶內(nèi)備用。

2.2 細(xì)胞存活率的檢測 將CNE-2細(xì)胞接種于96 孔板中，分別加入終濃度為 10、20、40、60、80、100 μmol/L的通關(guān)藤苷H，對照組不添加藥物，每組設(shè)6個復(fù)孔，各組作用24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗滌兩3次后加入新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃溫育2 h后，測定各組吸光度（A值）。所得A值按下列公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率%=通關(guān)藤苷H組A450值/對照細(xì)胞組A450值×100%。

2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測 將CNE-2細(xì)胞接種于6孔板中，藥物處理24 h后，棄去培養(yǎng)液后以PBS小心洗滌2次，加入用0.25%胰酶[不含乙二胺四乙酸（EDTA）]于37℃進(jìn)行消化，收集細(xì)胞懸液，以1 000 r/min，離心半徑 10 cm，離心 10 min，棄去上清，收集細(xì)胞后按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行AnnexinVFITC/PI染色，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲力的檢測 將對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞10 cm接種于培養(yǎng)皿中。把Transwell小室架于Transwell 24孔板上，按1∶7比例將50 mg/L Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)液混合均勻，取100 μL加至小室中央，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育6 h，然后棄去殘余液體。將細(xì)胞按2×105/孔接種至Transwell小室內(nèi)，下小室加入800 μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。CNE-2細(xì)胞在Transwell小室培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度通關(guān)藤苷H處理24 h，棄去培養(yǎng)液，無水乙醇固定細(xì)胞10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗滌后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)統(tǒng)計中間和四周5個視野細(xì)胞數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2.5 蛋白表達(dá)量的檢測 將在6孔板中培養(yǎng)好的CNE-2細(xì)胞用PBS沖洗2次，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液作用 30 min，12 000 r/min，離心半徑 10 cm，在 4 ℃下離心15 min，沉淀細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取上清液，BCA法測定蛋白量。用含12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA封閉90 min，加入稀釋好的一抗，在4℃條件下孵育過夜。洗膜后，加入二抗，37℃孵育1 h，洗滌2次，采用凝膠成像系統(tǒng)軟件分析膠片中蛋白條帶組的灰度面積，以內(nèi)參β-actin基準(zhǔn)計算各待測蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 MMP-2和MMP-9分泌量的檢測 將CNE-2細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生達(dá)到80%～90%時，加入以無血清培養(yǎng)基溶解的藥物處理24 h后，吸取上清液，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min去除細(xì)胞殘屑，按試劑盒說明書操作檢測MMP-2和MMP-9含量，以對照組為基準(zhǔn)，比較各藥物組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的相對分泌量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨立分組間比較采用t檢驗，組間兩兩比較采用SNK檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞存活率的影響 與對照組相比，當(dāng)通關(guān)藤苷H濃度高于20 μmol/L時，CNE-2細(xì)胞的存活率隨濃度增加而逐漸降低，各組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），當(dāng)濃度為80μmol/L時，通關(guān)藤苷H對細(xì)胞的抑制作用與60 μmol/L濃度組相比，并無明顯提高，而當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L時細(xì)胞的存活率又出現(xiàn)下降。出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是當(dāng)通關(guān)藤苷H濃度為60～80 μmol/L范圍時，細(xì)胞對藥物濃度的增加敏感性不高，藥物對細(xì)胞的抑制作用已達(dá)到平臺期，而當(dāng)濃度為100 μmol/L時，很可能藥物濃度偏高而使培養(yǎng)環(huán)境的理化因素出現(xiàn)明顯改變，致使細(xì)胞出現(xiàn)非藥理作用的壞死。因此，在后續(xù)實驗中，按 20、40、60 μmol/L 設(shè) 3 個濃度組進(jìn)行研究較為適合。見表1。

表1 不同劑量通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effect of different doses of tenacissoside H on survival rate of CNE-2 Cells

3.2 通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞凋亡率的影響 運用流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞的凋亡損傷情況，對凋亡細(xì)胞定量分析，細(xì)胞凋亡率為右上區(qū)與右下區(qū)細(xì)胞所占比例之和。對照組細(xì)胞凋亡率為4.8%，與之相比藥物組細(xì)胞凋亡率隨通關(guān)藤苷H濃度提高而增加，20、40、60 μmol/L 3 個濃度組細(xì)胞凋亡率依次為（24.0±3.8）%、（52.6±5.3）%、（68.4±5.8）%，各組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明通關(guān)藤苷H可促進(jìn)CNE-2細(xì)胞的凋亡。見圖1。

圖1 不同劑量通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 Effects of different doses of tenacissoside H on the apoptotic rate of CNE-2 cells

3.3 通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響 鏡下細(xì)胞數(shù)量結(jié)果如圖2所示，與對照組CNE-2細(xì)胞比較，隨著通關(guān)藤苷H濃度的增加，CNE-2細(xì)胞侵蝕基質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)移至下室的數(shù)量逐漸減少，圖3所示為采用目鏡微尺的細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果，各藥物組與對照組的細(xì)胞數(shù)量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

圖2 Transwell下室細(xì)胞染色顯微鏡觀察結(jié)果（×200）Fig.2 Microscopic observation of Transwell’s inferior ventricular cells(×200)

圖3 Transwell下室細(xì)胞染色顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)（×200）Fig.3 Microscopic observation of Transwell’s inferior ventricular cells(×200)

3.4 通關(guān)藤苷H對p-Akt/p-GSK-3β/Cyclin D1通路的影響 蛋白免疫印跡（WB）的顯影條帶如圖4A所示，與對照組相比，隨著通關(guān)藤苷H濃度的遞增，CNE-2細(xì)胞中p-Akt的含量逐漸下降而p-GSK-3β的含量逐漸增加，同時Cyclin D1的相對表達(dá)量相應(yīng)下調(diào)。圖4B所示為根據(jù)WB條帶的灰度值換算成蛋白相對含量的百分比，經(jīng)統(tǒng)計分析，各藥物組與對照組蛋白含量的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 不同劑量通關(guān)藤苷H對p-Akt/p-GSK-3β/Cyclin D1通路的影響Fig.4 Effect of different doses of tenacissoside H on p-Akt/p-GSK-3β/Cyclin D1 pathway

3.5 通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲蛋白含量的影響 WB的顯影條帶如圖5A所示，與對照組CNE-2細(xì)胞比較，通關(guān)藤苷H可隨濃度遞增而逐漸上調(diào)E-cadherin和下調(diào)N-cadhexin、Vimentin的含量。圖5B所示為根據(jù)WB條帶的灰度值換算成蛋白相對含量的百分比，經(jīng)統(tǒng)計分析各藥物組與對照組的蛋白含量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 不同劑量通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different doses of tenacissoside H on the content of metastasis and invasion protein of CNE-2 cells

3.6 MMP-2和MMP-9分泌量的檢測 Elisa檢測結(jié)果如圖6所示，與對照組比較，3個藥物組培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的相對含量隨通關(guān)藤苷H濃度增加而逐漸減少，各藥物組與對照組的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 不同劑量通關(guān)藤苷H對MMP-2和MMP-9分泌量影響Fig.6 Effect of different doses of tenacissoside H on MMP-2 and MMP-9 secretion

4 討論

NPC發(fā)病初期并無特征性癥狀，易與其他鼻咽疾病混淆，且發(fā)病早期可出現(xiàn)浸潤生長，不少初診患者即伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是鼻咽癌治療欠佳的主要原因[7-8]。鼻咽癌細(xì)胞的惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力與其分化程度密切相關(guān)，分化程度越低，增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力也相對較強(qiáng)，患者的預(yù)后情況也越不理想[9]，開發(fā)能夠有效抑制低分化鼻咽癌的藥物是目前研究重點之一，因此本文使用低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2作為研究對篩選有效藥物的對象具有的實際參考意義。

腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移涉及到多種細(xì)胞信號通路[10-11]，包括 Traf6/TAK1、Wnt/β-catenin、Akt、GSK-3β、Cyclin D1 等，其中 Akt/GSK-3β/Cyclin D1通路與腫瘤細(xì)胞的快速增殖有著密切聯(lián)系。Akt對下游通路蛋白GSK-3β具有反向的調(diào)控作用，Akt經(jīng)過第二信使PI3K磷酸化激活后，可抑制其下游的通路蛋白GSK-3β的磷酸化修飾，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖生長。GSK-3β屬于絲氨酸/蘇氨酸類激酶，在磷酸化生成p-GSK-3β之前，GSK-3β可延長下游的信號通路蛋白Cyclin D1的半衰期，促使細(xì)胞增殖加快乃至發(fā)生癌變惡化[10-11]。Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白的中最重要的一員，其過度上調(diào)表達(dá)可使細(xì)胞增殖失控，迅速從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長、轉(zhuǎn)移和代謝[12]。據(jù)此，本文選擇檢測Akt/GSK-3β/Cyclin D1的信號通路考察通關(guān)藤苷H對CNE-2細(xì)胞增殖與凋亡的影響。實驗結(jié)果顯示，通關(guān)藤苷H通過抑制Akt的磷酸化激活，加強(qiáng)GSK-3β對Cyclin D1的抑制作用，遏制細(xì)胞周期的進(jìn)展，最終抑制CNE-2細(xì)胞的生長和增殖[13]。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮源性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的首要階段，主要發(fā)生機(jī)制為不同亞型鈣黏附蛋白（Cadherin）之間的轉(zhuǎn)換[14]。其中E-cadherin是維持上皮細(xì)胞之間的連接黏附，保持細(xì)胞聚集功能的主要分子，因而在正常細(xì)胞組織中保持高水平表達(dá)，若其表達(dá)水平降低，則可導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)合體解離；而Cadherin另一個亞型N-cadherin的作用則與之相反，其在某些生長因子的作用下可使細(xì)胞復(fù)合體解離，在腫瘤細(xì)胞侵襲、浸潤、轉(zhuǎn)移的過程中起到促進(jìn)作用[15-16]。波形蛋白（Vimentin）是中間絲蛋白家族的主要成員，其多聚體是與肌動蛋白和微管蛋白共同構(gòu)成細(xì)胞骨架蛋白的關(guān)鍵成分，研究發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞侵襲和遷移的過程中，游離Vimentin含量的不斷增加，意味著細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生解離，是EMT開始進(jìn)展的信號[17]。本文實驗結(jié)果表明，通關(guān)藤苷H可以抑制E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)化，并維持Vimentin多聚體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[18]。

大量臨床研究表明鼻咽癌的轉(zhuǎn)移與MMPs的過度表達(dá)分泌密切相關(guān)，包括 MMP-1、2、7、9、13、14等眾多家族成員，涉及細(xì)胞間質(zhì)、基底膜膠原蛋白的降解以及骨質(zhì)的侵蝕[19-20]。在各種MMPs成員中MMP-2和MMP-9與腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切，MMP-2和MMP-9主要降解的底物為IV型膠原、明膠、彈力蛋白等組織基底膜的主要成分，而基底膜的降解是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵襲與轉(zhuǎn)移首要階段[21]。因此本文選用MMP-2和MMP-9作為檢測指標(biāo)，并選用富含層粘連蛋白、Ⅳ型膠原的Matrigel膠作為Transwell實驗培養(yǎng)皿的基質(zhì)進(jìn)行研究。本文實驗表明，隨著通關(guān)藤苷H的濃度增加，CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)基中的MMP-2和MMP-9含量逐漸減少，結(jié)合Transwell實驗結(jié)果分析，可推斷通關(guān)藤苷H能夠抑制CNE-2細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9降低其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者確診后均需接受放療和化療，其營養(yǎng)狀態(tài)、骨髓功能及心理承受能力均隨病情的發(fā)展和藥物不良反應(yīng)的增加而逐漸下降，再次接受治療預(yù)后欠佳。采用有效低毒的藥物進(jìn)行維持治療，以提高生存質(zhì)量為目標(biāo)，盡可能延長生存時間，已成為治療轉(zhuǎn)移性鼻咽癌一種可行的方案。天然植物抗腫瘤藥物具有低毒高效的優(yōu)點，本實驗研究表明消癌平注射液中的通關(guān)藤苷H對于低分化鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移均具有抑制作用，進(jìn)一步明確消癌平注射液可應(yīng)用于治療鼻咽癌，而其有效成分通關(guān)藤苷H可研制成單一成分的抗癌藥物，相對于消癌平注射液或通關(guān)藤總苷等復(fù)方藥物，通關(guān)藤苷H的單成分制劑更有利于臨床應(yīng)用上調(diào)整藥物的劑量和降低不良反應(yīng)，為鼻咽癌患者提供更好的治療方案。