熊桅，朱振剛，劉超武，狄冠麟

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300381）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）作為一種復(fù)雜的慢性異質(zhì)性氣道疾患，在中國總體發(fā)病率為4.2%，患者已超過4 000萬人，且發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]，嚴(yán)重影響了人類健康。雖然哮喘發(fā)病機制尚未完全明確，但嗜酸性粒細胞（EOS）已被廣泛接受為參與哮喘發(fā)病過程的重要細胞，一些證據(jù)表明，哮喘嚴(yán)重程度的加劇與呼吸道黏膜的持續(xù)性EOS增多及其產(chǎn)生的細胞因子等多種介質(zhì)相關(guān)[2]。而EOS趨化因子（Eotaxin）-1（CCL11）、Eotaxin-2（CCL24）和Eotaxin-3（CCL26）同作為CC亞家族中的EOS活化趨化因子，三者具有相似的生物學(xué)作用，即通過與EOS表面的CC趨化因子受體3（CCR3）相結(jié)合，進而趨化并激活EOS。有研究證明，Eotaxin和CCR3的結(jié)合在哮喘炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，其可能參與EOS從骨髓游走至炎癥器官的過程[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)CCR3受體介導(dǎo)的經(jīng)CCL11、CCL24誘導(dǎo)的人與小鼠嗜酸細胞活化需要特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在CCL11或CCL24與細胞表面受體結(jié)合條件下，G蛋白αi亞基激活，并可能通過結(jié)合三磷酸鳥苷（GTP）偶聯(lián)蛋白釋放的β-γ亞基的方式激活磷酶肌醇3-激酶（PLK3），進一步激活其下游信號通路細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）及絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK），并且用特異性的CCR3受體拮抗劑、G 蛋白阻抑劑、PLK3、P38MAPK、ERK 通路拮抗劑可以明顯減少CCL11、CCL24誘導(dǎo)嗜酸細胞脫顆粒活性。

對于哮喘的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以藥物控制為主，而中醫(yī)學(xué)以“若因風(fēng)者，辛平解之”為原則[5]“疏風(fēng)通絡(luò)”為治法，?？扇〉蔑@著療效。前期研究發(fā)現(xiàn)，本科院內(nèi)制劑疏風(fēng)通絡(luò)方不僅可以誘導(dǎo)EOS凋亡，從而減輕炎癥反應(yīng)，同時對哮喘大鼠肺組織中的EOS跨膜遷移具有干預(yù)作用[6-9]?；趯κ人峒毎鸈otaxin/CCR3通路的認(rèn)識，本實驗以Ga蛋白拮抗劑（PTX）、CCR3受體拮抗劑（SB328437）、PLK3蛋白拮抗劑（LY294002）、P38蛋白激酶拮抗劑（SB203580）、絲裂原活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑（PD98059）作為陽性對照藥，以觀察疏風(fēng)通絡(luò)方對哮喘模型小鼠Eotaxin/CCR3通路各階段相關(guān)因子的調(diào)控，探討疏風(fēng)通絡(luò)方治療哮喘的多靶點分子機制，并驗正其可通過調(diào)控Eotaxin/CCR3通路抑制哮喘炎癥，為臨床應(yīng)用疏風(fēng)通絡(luò)方治療哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 70只野生型、體質(zhì)量為（20±2）g的SPF級雄性C57BL/6小鼠（北京維通利華實驗動物公司），將所有小鼠置于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物中心飼養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)的實驗鼠飼料喂養(yǎng)，水和飼料均自由攝取，給予持續(xù)燈光照射12 h，保證室溫和相對濕度適宜，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后正式實驗。

1.2 實驗藥物 疏風(fēng)通絡(luò)方組成：蟬蛻6 g，地龍10 g，白僵蠶 10 g，炙麻黃 6 g，荊芥穗 6 g，半夏10 g，杏仁 10 g，黃芩 10 g，丹參 30 g，甘草 6 g 等，飲片批號：019010317958，將飲片制成規(guī)格為含生藥4 g/mL濃縮液（天津中醫(yī)一附院藥廠制劑室）。

1.3 試劑與儀器 卵白蛋白（美國Sigma-Aldrich公司），SB328437、LY294002、SB203580、PD98059、Anti-CCR3抗體（美國Abcam公司），普通RIPA裂解液、PBS緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司），PTX百日咳毒素（美國List Labs公司），氫氧化鋁粉劑（天津天力生化有限公司），動物組織總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，0.1 mL PCR八聯(lián)排管平蓋（美國GENEBRICK公司），0.5 mL PCR管平蓋（美國AXYGEN公司），PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴增試劑盒（美國GeneCopoeia公司），移液器（德國艾本德股份公司），電子天平、超凈臺、搖床、-80℃超低溫冰箱（美國賽默飛世爾科技公司），高通量多樣品組織研磨機（南京先歐儀器制造有限公司），熒光定量PCR儀（LightCycler 96）（天津華利源科技有限公司），通用SP檢測試劑盒、Mayer蘇木素染液（免疫組化）、ECL Plus超敏發(fā)光液、抗體稀釋液（普通型）、小鼠CCL11 ELISA、小鼠CCL24 ELISA（南京建成生物工程研究所），Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）Secondary Antibody、HRP Conjugate（武漢博士德生物工程有限公司），恒溫培養(yǎng)振蕩器（KHY-100）（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）超微量紫外可見分光光度計（美國DeNovix公司），BPX-162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），正置光學(xué)顯微鏡（BX43）（日本奧林巴斯株式會社）。

1.4 哮喘小鼠模型建立 應(yīng)用卵清蛋白吸入致敏激發(fā)法建立哮喘小鼠模型，分別于實驗第0天與第14天腹腔注射致敏液（OVA）0.2 mL，從第24天開始將小鼠放于一自制密閉容器（20 cm×40 cm×50 cm）中，每日給予1次30 min的霧化吸入（2.5%OVA溶液20 mL），連續(xù)7 d，建立哮喘模型。

1.5 分組與給藥 將70只小鼠隨機分為：空白對照組、哮喘模型組、疏風(fēng)通絡(luò)方低劑量組（簡稱中藥低劑量組）、疏風(fēng)通絡(luò)方中劑量組（簡稱中藥中劑量組）、疏風(fēng)通絡(luò)方高劑量組（簡稱中藥高劑量組）、PTX 組、SB328437組、LY294002組、SB203580組、PD98059組，每組各7只，中藥組在第30天激發(fā)完畢后分別給予低劑量7.75 g/kg，中劑量15.5 g/kg，高劑量30 g/kg的疏風(fēng)通絡(luò)方0.2 mL灌胃，連續(xù)給藥4 d，哮喘模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，拮抗劑組則在生理鹽水灌胃基礎(chǔ)上采用腹腔注射的方法給予相應(yīng)拮抗劑0.2 mL。

1.6 組織取材與檢測 眼球放血處死小鼠，應(yīng)用氣管灌注固定法獲取小鼠肺組織，將沿左肺門處斜形切取的2 mm肺葉經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后制成石蠟切片以備免疫組化檢測。以滅酶剪刀摘除右肺，置于滅酶凍存管保存于-80℃冰箱，留測 CCL11、CCL24、CCR3 基因表達及 CCL11、CCL24含量。

1.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測肺組織中CCR3 mRNA、CCL11 mRNA、CCL24 mRNA 含量 將配制的25μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液短暫離心后置于37℃溫育60 min，隨后置于85℃孵育5 min。未純化的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，直接進行實時熒光PCR。引物序列見表1，將試劑盒中的All-in-One TM qPCR Mix解凍、混勻、離心等處理后配置成qPCR預(yù)混液以用于qPCR反應(yīng)，最后按3步法PCR程序開始qPCR反應(yīng)。用Realtime-PCR定量分析軟件自動生成擴增動力曲線和溶解曲線，以相對定量法分析數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCt表示實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)，ΔΔCt=（Ct目的-Ct內(nèi)參）處理組-（Ct目的-Ct內(nèi)參）對照組。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.8 免疫組化法檢測肺組織CCR3含量 小鼠肺組織切片常規(guī)脫臘至水，滴加稀釋的一抗37℃孵育1 h左右，PBS液洗滌2 min×3次，并滴加Bio-羊抗小鼠/兔lgG工作液，20～37℃孵育30 min，PBS液洗滌2 min×3次，隨后滴加鏈酶親和素-POD工作液，20～37℃，30 min，接著應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液室溫顯色，鏡下把反應(yīng)時間控制在5～30 min之間，最后蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)，顯微鏡觀察，判斷標(biāo)準(zhǔn)是肺組織中CCR3陽性細胞胞漿呈棕黃色染色，隨機選取4個高倍視野（10×40）免疫組化切片拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定采集的圖像的平均光密度值。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測肺組織中CCL11、CCL24含量 切取肺組織后，稱取30 mg肺組織，用勻漿器將肺組織勻漿充分、離心，仔細收集上清，分裝后待檢?？瞻卓祝杭语@色劑A、B和終止液用于調(diào)零；標(biāo)準(zhǔn)品孔：每孔需加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；零孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液和生物素抗原工作液各50 μL；樣品孔：加入樣品和生物素抗原工作液各50μL，隨后進行孵育、洗滌、吸附、第2次孵育、第2次洗滌，最后將每孔先后加入顯色劑A和B各50 μL，輕輕震蕩混勻，放于37℃避光顯色10 min后終止反應(yīng)（此時可見藍色立轉(zhuǎn)黃色），以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下，加終止液后10 min內(nèi)依次檢測各孔的吸光度（OD值），并根據(jù)濃度和OD值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，用專用計算軟件進行計算，使用ELISAcalc對其進行計算，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

卵清蛋白致敏/激發(fā)法建立小鼠哮喘模型成功，小鼠肺組織病理切片特征符合支氣管哮喘病理表現(xiàn)，即小鼠肺組織、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，支氣管管腔變狹窄，肺組織中可見大量以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞以及中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，氣管黏膜下可見組織水腫，皺襞增多等表現(xiàn)，哮喘模型病理切片見圖1。

圖1 哮喘模型小鼠肺組織切片HE染色（×400）Fig.1 HE staining of lung tissue sections of asthmatic mice（×400）

2.1 各組肺組織CCR3 mRNA相對定量結(jié)果 模型組與空白對照組比較，CCR3基因表達水平明顯升高，且兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；各中藥組和拮抗劑組分別與模型組比較，各中藥組CCR3基因表達水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但各中藥組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，SB328437組CCR3基因表達水平下降明顯，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而其他拮抗劑組CCR3基因表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組肺組織CCR3基因表達相對定量結(jié)果Fig.2 Relative quantitative results of CCR3 gene expression in lung tissue of each group

2.2 各組肺組織CCL11mRNA相對定量結(jié)果 模型組CCL11基因表達水平明顯高于空白對照組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低劑量組CCL11基因表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），中藥中劑量組和中藥高劑量組CCL11基因表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但各中藥組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，SB328437組CCL11基因表達水平降低，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而其他拮抗劑組CCL11基因表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組肺組織CCL11基因表達相對定量結(jié)果Fig.3 Relative quantitative results of CCL11 gene expression in lung tissue of each group

2.3 各組肺組織CCL24mRNA相對定量結(jié)果 模型組CCL24基因表達水平顯著高于空白對照組，且兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)中藥或拮抗劑干預(yù)，各中藥組與拮抗劑組分別與模型組比較，CCL24基因表達水平雖均有下降趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 各組肺組織CCL24基因表達相對定量結(jié)果Fig.4 Relative quantitative results of CCL24 gene expression in lung tissue of each group

2.4 免疫組化結(jié)果 模型組CCR3含量明顯高于空白對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)中藥干預(yù)后，中藥低、中、高劑量組CCR3含量不同，中藥低劑量組CCR3含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），中藥中劑量組CCR3含量有所下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但疏風(fēng)通絡(luò)方高劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SB328437組與模型組比較CCR3含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他拮抗劑組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具體數(shù)值見表2。免疫組化染色，見圖5。

圖5 各組肺組織CCR3免疫組化染色Fig.5 CCR3 immunohistochemical staining of lung tissue in each group

表2 各組肺組織CCR3含量Tab.2 The content of CCR3 in lung tissue of each group

2.5 ELISA檢測結(jié)果 模型組與空白對照組比較，小鼠肺組織中CCL11含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），CCL24含量也存在上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)中藥干預(yù)后，中藥中劑量組CCL11與CCL24含量均有所下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而其他中藥組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SB328437組CCL11含量與模型組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），CCL24含量與模型組比較也有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他拮抗劑組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具體數(shù)值見表3。

表3 各組肺組織CCL11、CCL24含量Tab.3 Contents of CCL11 and CCL24 in lung tissue of each group

3 討論

哮喘是一種由多種氣道炎性細胞、結(jié)構(gòu)細胞及細胞組分參與的慢性異質(zhì)性呼吸道疾患[10]，其中嗜酸性粒細胞與哮喘的發(fā)病過程有著密切關(guān)系，當(dāng)Eotaxin和EOS表面的CCR3結(jié)合后，可趨化并激活EOS，誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生，從而引發(fā)喘息、氣短、胸悶等癥狀。前期研究發(fā)現(xiàn)，疏風(fēng)通絡(luò)方治療哮喘的機制可能是通過抑制哮喘模型Wistar大鼠肺組織EOS的跨膜遷移而發(fā)揮作用[9]。然而哮喘氣道慢性炎癥的病理生理改變是一個較為復(fù)雜的過程，其與多種信號通路相關(guān)，而Eotaxin/CCR3通路是參與這一過程的重要路徑，因此研究疏風(fēng)通絡(luò)方調(diào)控哮喘小鼠該通路相關(guān)因子具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，疏風(fēng)通絡(luò)方具有降低哮喘模型小鼠肺組織中EOS趨化因子CCL11及其受體CCR3基因表達水平、減少哮喘模型小鼠肺組織中EOS趨化因子CCL11、CCL24及CCR3蛋白水平含量的作用，從而抑制EOS的遷移與活化，減少EOS在氣道的浸潤，達到控制哮喘氣道炎癥的療效，進一步揭示了疏風(fēng)通絡(luò)方防治哮喘良好臨床效果的分子機制。而Eotaxin/CCR3通路依賴嗜酸細胞趨化因子與細胞表面受體CCR3結(jié)合后激活G蛋白偶聯(lián)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和級聯(lián)放大作用，通過PLK3通路并進一步激活其下游信號通路ERK及P38MAPK的磷酸化以促使EOS活化并脫顆粒。故在既往研究中，Eotaxin/CCR3通路各階段拮抗劑均具有抑制嗜酸細胞活化作用，而本實驗設(shè)計了PTX、SB328437、LY294002、SB203580、PD98059 等拮抗劑作為疏風(fēng)通絡(luò)方的陽性對照藥，比較了中藥與相關(guān)拮抗劑對Eotaxin/CCR3通路相關(guān)因子含量與基因表達的影響。有趣的是，本實驗發(fā)現(xiàn)疏風(fēng)通絡(luò)方中藥組具有減少嗜酸細胞趨化因子及其受體含量和相應(yīng)基因表達的作用，且與CCR3受體拮抗劑的作用類似，而Eotaxin/CCR3通路的下游阻斷劑，如 LY294002、SB203580、PD98059卻沒有表現(xiàn)出預(yù)期的抑制效應(yīng)，具體原因還有待進一步研究。值得注意的是，本研究結(jié)果提示中藥中低劑量組對CCL11、CCL24、CCR3水平有較好抑制作用，而中藥高劑量組反而沒有明顯效果，這可能反映了中醫(yī)藥療法需要在合適的劑量范圍內(nèi)才能發(fā)揮最優(yōu)治療作用，課題組下階段將繼續(xù)深入探索疏風(fēng)通絡(luò)方防治哮喘的量-效關(guān)系及藥效學(xué)物質(zhì)。