徐進(jìn)，譚均，楊美森，張應(yīng)

(1.重慶市中藥研究院，重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，重慶 400065；2.秀山縣中藥材產(chǎn)業(yè)中心，重慶 秀山 409900)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgobiloba)秋季葉尚綠時(shí)采收的干燥葉[1]，含有廣泛的具藥理活性化學(xué)成分，尤其是黃酮類和萜類化合物[2-3].銀杏葉提取物具有擴(kuò)張血管、改善腦循環(huán)、抑制血小板活化因子的作用[4]，是當(dāng)今世界最熱門的植物藥產(chǎn)品之一[5].為了適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)對(duì)銀杏葉質(zhì)量的要求，國內(nèi)從1992年開始發(fā)展用于收獲綠葉的葉用銀杏種植基地[6]，針對(duì)與果用、林用銀杏生產(chǎn)特性的差異，開展了葉用銀杏良種選育、密度控制、營養(yǎng)調(diào)控等種植技術(shù)的研究[6-7].

種子種苗是中藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]，優(yōu)質(zhì)種苗是提高藥材產(chǎn)量、質(zhì)量和用藥安全性的根本保障[9].我國中藥材主要栽培品種有300多種，目前中藥材種子種苗地方標(biāo)準(zhǔn)只頒布130多項(xiàng)，涉及91個(gè)中藥材品種，人參、甘草等5項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)，人參、三七兩項(xiàng)國際標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，中藥材種子種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究及標(biāo)準(zhǔn)制訂仍需加快進(jìn)程.近年來，重慶地區(qū)開始大量發(fā)展葉用銀杏種植基地，但種源混亂，種質(zhì)混雜，種苗質(zhì)量參差不齊，且無葉用銀杏種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可供借鑒[11-13]，嚴(yán)重制約葉用銀杏規(guī)范化生產(chǎn).本文收集重慶地區(qū)葉用銀杏實(shí)生苗，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際開展種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究，旨在為葉用銀杏種苗標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)，規(guī)范種植源頭，保障葉用銀杏種苗生產(chǎn)及流通，促進(jìn)重慶地區(qū)葉用銀杏的規(guī)范化發(fā)展.

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)材料

2018年12月在重慶葉用銀杏主產(chǎn)區(qū)云陽、秀山、彭水、萬州等縣/區(qū)共收集30個(gè)批次葉用銀杏種苗，樣品編號(hào)和具體產(chǎn)地見表1.所有種苗均為采自育苗基地樹齡2 a的實(shí)生苗，每批樣品隨機(jī)選取100株，經(jīng)重慶市中藥研究院瞿顯友研究員鑒定為植物銀杏(Ginkgobiloba).

表1 30批葉用銀杏種苗來源

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Angilent 1260高效液相色譜儀及Chem Station工作站(美國安捷倫公司)；Alltech 2000 ES蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰公司)，QUINTIX125D-1CN十萬分之一天平(德國賽多利斯公司)，Mill-Q advantage A10超純水儀(法國默克密理博公司).

1.2.2 試劑 銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、槲皮素、山奈酚、異鼠李素對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為190515 02、19090505、19092601、19101701、19101104、18101911和19080310)；純度≥99%(HPLC).液相用甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純.

2 方法

2.1 種苗質(zhì)量指標(biāo)的測定

測定每株種苗的株高、地徑、主根長、一級(jí)側(cè)根數(shù)、分枝數(shù)，統(tǒng)計(jì)每批次種苗分枝率.株高測定采用精度為1 mm直尺測量種苗地上部分長度；地徑測定采用游標(biāo)卡尺測量地上部分離地2 cm處非膨大處直徑；主根長測定采用精度為1 mm直尺測量種苗主根長度；一級(jí)側(cè)根數(shù)為主根上超過2 cm的側(cè)根數(shù)量；分枝數(shù)為主干上長于2 cm的分枝數(shù)量；分枝率為同批次中具有分枝的種苗占種苗總數(shù)百分比.

2.2 種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制訂

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)葉用銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述、相關(guān)性分析和聚類分析，根據(jù)分析結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)際按照最低定級(jí)原則制訂銀杏種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，即同一等級(jí)種苗的任一指標(biāo)若達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)則降為下一級(jí).

2.3 種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證試驗(yàn)

2018年12月底，選取同一來源1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)和不合格葉用銀杏種苗，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，共12個(gè)區(qū)組，每個(gè)小區(qū)100 株，按株行距0.5 m×0.6 m，定植于重慶市博責(zé)農(nóng)業(yè)公司基地.

2019年8月底葉片尚綠時(shí)，選擇連續(xù)多日晴天后采收，采收前統(tǒng)計(jì)各小區(qū)成活率，每小區(qū)隨機(jī)選取10株測定生長指標(biāo)和單株葉鮮重.成活率為每小區(qū)內(nèi)成活植株占定植總株數(shù)的比率；新發(fā)主莖長測定采用精度為1 mm直尺測量本年度新生主莖長度；總分枝數(shù)為末端枝條超過2 cm的枝條總數(shù)；新發(fā)枝條數(shù)為當(dāng)年從主干或枝條上萌發(fā)出超過2 cm枝條數(shù)量；葉片數(shù)為所有正常伸展葉片總數(shù).將各小區(qū)銀杏葉稱重后，帶回實(shí)驗(yàn)室50 ℃烘干至恒重，計(jì)算折干率，粉碎過60目篩后用于質(zhì)量測定.

2.4 藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)

銀杏葉含量按《中國藥典》(2020版一部)方法進(jìn)行測定[1].

3 結(jié)果與分析

3.1 種苗質(zhì)量的測定

對(duì)30批葉用銀杏種苗株高、地徑、主根長等6個(gè)質(zhì)量指標(biāo)的測定結(jié)果見表2，各質(zhì)量指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3.不同產(chǎn)地種苗的株高、地徑、根長、一級(jí)側(cè)根數(shù)、分枝數(shù)等指標(biāo)差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，均可作為葉用銀杏種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù).各質(zhì)量指標(biāo)變異幅度分別為株高13.00～135.00 cm、地徑3.09～18.53 mm、主根長1.00～50.00 cm，一級(jí)側(cè)根數(shù)1～50根，分枝數(shù)0～14枝，分枝率3%～78%.變異程度為分枝率>分枝數(shù)>一級(jí)側(cè)根數(shù)>主根長>株高>地徑.

表2 30批葉用銀杏種苗質(zhì)量測定

表3 葉用銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析 (n=3 000)

3.2 種苗質(zhì)量分級(jí)指標(biāo)的確定

葉用銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)分析見表4.葉用銀杏種苗株高與地徑、平均分枝數(shù)、分枝率極顯著正相關(guān)(P<0.01)；主根長與一級(jí)側(cè)根數(shù)存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)；主根長與株高、分枝率顯著正相關(guān)(P<0.05).說明葉用銀杏種苗地上、地下部分的質(zhì)量指標(biāo)分別具有極顯著相關(guān)性，地上和地下部分的生長又具有關(guān)聯(lián)性.

30批銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)的主成分分析結(jié)果見表5.主成分因子1、因子2特征值均大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.01%，具有較強(qiáng)的信息代表性，可以概括種苗質(zhì)量.決定因子1大小的主要指標(biāo)為株高、地徑和分枝率性狀分量，決定因子2大小的主要指標(biāo)為根長、一級(jí)側(cè)根數(shù)和平均分枝數(shù)性狀分量.理論上株高等6個(gè)指標(biāo)均可作為銀杏苗的分級(jí)參考指標(biāo).

表4 葉用銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)分析

表5 各質(zhì)量指標(biāo)的特征向量及貢獻(xiàn)率

根據(jù)葉用銀杏種苗株高等6項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行K-均值聚類，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際擬分為3個(gè)等級(jí)，得到3個(gè)等級(jí)種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最終聚類中心值，見表6；分級(jí)指標(biāo)的方差分析結(jié)果見表7.F值從大到小依次為分枝率>株高>地徑>主根長>平均分枝數(shù)>一級(jí)側(cè)根數(shù)，不同批次銀杏種苗間株高、地徑、分枝率差異顯著.

表6 葉用銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)K-均值聚類的最終類中心值

表7 葉用銀杏種苗質(zhì)量指標(biāo)的方差分析

因此，6個(gè)質(zhì)量指標(biāo)均能反映種苗質(zhì)量；株高、地徑、分枝率對(duì)分級(jí)影響顯著，應(yīng)作為分級(jí)指標(biāo)；一級(jí)側(cè)根數(shù)、平均分枝率對(duì)分級(jí)影響不顯著，不同等級(jí)最終聚類中心值差異不大，可作為約束性指標(biāo)；因種苗移栽時(shí)須剪去過長主根，以促進(jìn)側(cè)根和一級(jí)側(cè)根生長，生產(chǎn)上考察主根長意義不大，不建議作為分級(jí)指標(biāo).

3.3 種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定

聚類分析各類間中心距離結(jié)果見表8.第2類和第3類間中心距離最大，其次為第1類和第2類，第1類和第3類中心距離最小.說明30個(gè)不同來源銀杏種苗可劃分為3個(gè)質(zhì)量等級(jí)，第2類屬于一級(jí)苗，第1類屬于二級(jí)苗，第3類屬于三級(jí)苗.

表8 各指標(biāo)最終聚類各類間中心距離

以聚類中心值為參考，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際制定銀杏種苗等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，見表9.根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，30批銀杏種苗觀測樣本中一級(jí)種苗2批，二級(jí)種苗7批，三級(jí)種苗13批，不合格苗8批，分別占征集種苗批的6.67%、23.33%、43.3%和26.67%.

3.4 種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證

3.4.1 不同等級(jí)種苗生長情況 不同等級(jí)葉用銀杏種苗定植次年存活率和生長情況見表10.由表10可知，不同等級(jí)銀杏苗定植次年成活率、總分枝數(shù)、新發(fā)枝條數(shù)、葉片數(shù)、新發(fā)主莖長、單株鮮葉質(zhì)量具有一定差異，且差異顯著(P<0.05).其中一級(jí)苗總分枝數(shù)、葉片數(shù)、新發(fā)主莖長、單株葉片鮮重極顯著高于其他等級(jí).一、二級(jí)苗總分枝數(shù)、新發(fā)枝條數(shù)、葉片數(shù)極顯著高于三級(jí)苗和不合格苗，三級(jí)苗和不合格苗各生長指標(biāo)差異不顯著.

3.4.2 不同等級(jí)種苗產(chǎn)量 不同等級(jí)葉用銀杏種苗定植次年產(chǎn)量情況見表11.不同等級(jí)種苗定植次年的單株鮮葉質(zhì)量和折算畝產(chǎn)量均存在顯著差異，種苗等級(jí)越高產(chǎn)量越高.一級(jí)苗單株鮮葉質(zhì)量和折算畝產(chǎn)量最高，分別達(dá)59.0 g和46.53 kg/667 m2，該級(jí)單株鮮葉質(zhì)量顯著高于其他等級(jí)種苗，二級(jí)、三級(jí)和不合格苗間無顯著差異；二級(jí)苗折算畝產(chǎn)量與三級(jí)苗的無顯著差異，顯著高于不合格苗的.不同等級(jí)種苗種植次年產(chǎn)葉的折干率無顯著差異.

表9 葉用銀杏種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表10 不同等級(jí)葉用銀杏苗次年生長情況

3.4.3 不同等級(jí)種苗藥材質(zhì)量 對(duì)不同等級(jí)葉用銀杏種苗定植次年生產(chǎn)的銀杏葉藥材進(jìn)行質(zhì)量測定，結(jié)果見表12.不同等級(jí)種苗生產(chǎn)藥材的內(nèi)酯成分中銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C含量存在顯著差異，一級(jí)、二級(jí)苗含萜類內(nèi)酯含量顯著高于三級(jí)和不合格苗.不同等級(jí)種苗生產(chǎn)藥材的黃酮成分中異鼠李素、山奈酚含量存在顯著差異，不合格苗總黃酮醇苷最高，顯著高于三級(jí)苗，一級(jí)苗總黃酮醇苷最低，與二級(jí)苗無顯著差異，顯著低于三級(jí)苗.不同等級(jí)苗葉片中含萜類內(nèi)酯、總黃酮醇苷含量均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn).

表11 不同等級(jí)葉用銀杏苗次年產(chǎn)量情況

表12 不同等級(jí)葉用銀杏種苗藥材活性成分的含量

4 討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)重慶葉用銀杏育苗區(qū)30份葉用銀杏種苗的質(zhì)量考察和分析，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，選定株高、地徑、分枝率、一級(jí)側(cè)根數(shù)及平均分枝數(shù)作為重慶葉用銀杏種苗質(zhì)量分級(jí)指標(biāo)，將供試樣品分為3個(gè)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)苗：株高≥70 cm，地徑≥9.5 mm，分枝率≥70%；二級(jí)苗：株高60～70 cm，地徑8.5～9.5 mm，分枝率35%～70%；三級(jí)苗：株高≥50 cm，地徑≥7.5 mm，分枝率≥12%；且各級(jí)苗一級(jí)側(cè)根≥15條，平均分枝數(shù)≥2枝.

本分級(jí)與主要造林樹種苗木質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)略有差異，因根長度采挖時(shí)受人為因素影響較大，不能客觀定量，故未將根長納入分級(jí)指標(biāo)[12].種苗定植次年高等級(jí)苗成活率、成活后長勢、生物量積累均高于低等級(jí)苗，與蔣冬生等研究結(jié)果一致[11]，說明優(yōu)質(zhì)種苗更利于提高定植后成活率及產(chǎn)量[14].總黃酮醇苷和總含萜內(nèi)酯均為次生代謝產(chǎn)物，其形成機(jī)制復(fù)雜，受光照、水分、溫度等環(huán)境因素影響[15-16]，造成不同等級(jí)總黃酮醇苷及含萜內(nèi)酯存在顯著性差異.鑒于不同等級(jí)種苗黃酮和萜內(nèi)脂含量均超過藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明此等級(jí)劃分具有可行性，生產(chǎn)上建議一、二級(jí)苗作為葉用銀杏種苗使用.

根據(jù)中藥材生產(chǎn)規(guī)范化需要，為推進(jìn)中藥材種子種苗生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，近年來，中藥材種子種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展顯著.受植物生長特性影響，中藥材種子種苗分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究報(bào)道中種子質(zhì)量分級(jí)研究多于種苗質(zhì)量分級(jí)研究，種子種苗質(zhì)量分級(jí)研究則集中在一年生或多年生草本類藥材，如素花黨參[17]、黃連[18]、魚腥草[19]、甘草[20]等，木本類藥材種苗質(zhì)量分級(jí)報(bào)道較少，僅見忍冬[21]、連翹[22]、刺五加[23]、枳殼[24]等藥材.然而，多年生藥材生產(chǎn)周期長，以花、果實(shí)、種子等入藥的多年生中藥材，投產(chǎn)周期均相對(duì)較長，種苗的品種及質(zhì)量選擇尤為重要，優(yōu)質(zhì)的種子種苗能夠提高存活率，有效提前投產(chǎn)年限，因此中藥材種子種苗質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究不容懈怠.