蔣玉輝 梁蔚陽

[摘要]目的建立豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶兩種成分的枸櫞酸離子含量測定的方法。方法采用高效液相色譜法，分析色譜柱為 Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為18 mmol/L 的磷酸二氫鈉-0.1%異丙醇溶液（磷酸調(diào)節(jié) pH 值至2.0），流速1 ml/min，柱溫40℃，檢測波長210 nm。采用標準曲線法進行分析。結(jié)果在該色譜條件下測得纖維蛋白原和凝血酶兩種成分中枸櫞酸離子的濃度線性范圍分別為1～9 mmol/L（ r=0.999）、0.1～0.9 mmol/L（ r=0.999）。加樣回收率分別為99.55%～102.63%（ n=18）、99.69%～101.61%（RSD=0.60%， n=12）。結(jié)論該方法操作簡單，準確性高，專屬性強，精密度、重復性、穩(wěn)定性好，可用于測定豬源纖維蛋白粘合劑中的枸櫞酸離子含量。

[關鍵詞]豬源纖維蛋白粘合劑;纖維蛋白原;凝血酶;枸櫞酸離子;高效液相色譜法

[中圖分類號] R28? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2021）23-0078-04

Determination of citrate ion in porcine fibrin adhesive by HPLC

JIANG? Yuhui??? LIANG? Weiyang

Guangdong Institute for Drug Control， Key Laboratory of Blood Products Quality Control of National Medical Products Administration， Guangdong， Guangzhou 510663， China

[Abstract] Objective To establish a method for determination of citrate ion content of fibrinogen and thrombin in porcine fibrin adhesive. Methods HPLC was used， the analytical column was Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm， 5μm）， the mobile phase was 18 mmol/L sodium dihydrogen phosphate -0.1% isopropanol solution （the pH value was adjusted to 2.0 by phosphoric acid）， the flow rate was 1 ml/min， the column temperature was 40℃ ， and the detection wavelength was 210 nm. The standard curve method was used for analyses. Results Under this chromatographic condition， the linear range of citrate concentration in fibrinogen and thrombin was 1-9 mmol/L （r=0.999） and 0.1-0.9 mmol/L （r=0.999）， respectively. The sample recovery rate was 99.55%-102.63%（n=18） and 99.69%-101.61%（RSD=0.60%， n=12）. Conclusion The method is simple， accurate， specific， precise， reproducible and stable， and can be used for the determination of citrate ion in porcine fibrin adhesive.

[Key words] Porcine fibrin adhesive; Fibrinogen; Thrombin; Citrate ion; High performance liquid chromatography

豬源纖維蛋白粘合劑是從健康豬血漿中分別分離、提純豬纖維蛋白原和豬凝血酶，并經(jīng)病毒去除和滅活處理、凍干制成。本品由豬纖維蛋白原及其稀釋劑、豬凝血酶及其稀釋劑4種成分組成，使用時將纖維蛋白原和凝血酶分別用稀釋劑復溶后，同時噴于出血創(chuàng)面，發(fā)揮止血作用[1-2]。

豬源纖維蛋白粘合劑中含有的枸櫞酸離子為枸櫞酸鈉，在豬血采集和生產(chǎn)工藝中引入，因其具有局部抗凝的作用[3-4]，會影響該藥的止血功效，因此在該藥品的質(zhì)量標準中要控制其含量。枸櫞酸離子的含量測定，國內(nèi)外文獻報道的方法有紫外-可見分光光度法[5-6]、酸堿滴定法[7]、離子色譜法[8-9]、全自動酶法[10]、高效液相色譜法[11-14]和離子交換-中和滴定法[15]等。本實驗建立的 HPLC 法可以快速準確測定豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶兩種成分的枸櫞酸離子含量，為豬源纖維蛋白粘合劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

高效液相色譜儀（2695/2487，美國 Waters 公司）;電子分析天平（CPA-225D，德國 Sartorius 公司）;真空恒溫干燥箱（VOS-451SD，日本 EYELA 公司）;超純水發(fā)生器（美國 Millipore 公司）。

1.2試藥

枸櫞酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100396-201603，含量100.0%）;異丙醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。豬纖維蛋白原（A 公司，批號：20131220、20141021、20150605、20150708、20150810; B 公司，批號：F201501002、BC201501005、 BC201511006），豬凝血酶（A 公司，批號：20110704、20141007、20131213、20150606、20150708、20150811）。

1.3色譜條件

色譜柱為 WelchUltimateAQ-C18（4.6mm×250 mm，

5μm）;柱溫：40℃;流動相：18.0 mmol/L 磷酸二氫鈉-0.1%異丙醇溶液（磷酸調(diào)節(jié) pH 至2.0）;流速1.0ml/min;紫外檢測器波長210nm;進樣量：20μl。1.4溶液的制備

1.4.1枸櫞酸對照品儲備液精密稱取經(jīng)105℃干燥2 h 的枸櫞酸對照品（C6H8O7，分子量192.14，含量100.0%）1.92 g，用水溶解并定容至100 ml，搖勻得到100 mmol/L 的儲備液。

1.4.2供試品溶液的制備各取樣品1瓶，按標示量加水復溶后，精密量取1 ml，根據(jù)供試品的蛋白質(zhì)濃度，加入適量1.5%磺基水楊酸溶液，混勻。室溫靜置2 h，3000 r/min 離心10 min，取上清液過濾，取續(xù)濾液即得。

1.5標準曲線的制備

精密量取“1.4.1”項下對照品儲備液各適量，分別用水稀釋成適當濃度的系列對照品溶液。纖維蛋白原的標準曲線濃度為1、3、5、7、9 mmol/L，凝血酶的標準曲線濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L。按“1.3”項下實驗條件進樣測定。以枸櫞酸的摩爾濃度（x，mmol/L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。

2結(jié)果

2.1典型色譜圖及回歸方程

對照品溶液和供試品溶液的典型色譜圖見圖1，枸櫞酸峰出峰時間穩(wěn)定，峰形良好，與相鄰峰的分離度符合要求。回歸方程與線性范圍見表1。

2.2方法學驗證結(jié)果

2.2.1定量限與檢測限考察精密量取“1.4.1”項下對照品儲備液適量，倍比稀釋，并按“1.3”項下實驗條件進樣測定，當信噪比為10∶1時，得定量限，為0.5946 nmol;當信噪比為3∶1時，得檢出限，為0.0991 nmol。

2.2.2精密度實驗取豬纖維蛋白原（批號20131220）和豬凝血酶（批號20150811）樣品，連續(xù)進樣6次，枸櫞酸峰面積的 RSD 分別為0.2%、0.5%，表明精密度良好。

2.2.3重復性實驗取豬纖維蛋白原（批號20150605）和豬凝血酶（批號20141007）樣品，按“1.4.2”項下分別制備6份供試品溶液，按“1.3”項下實驗條件測定，根據(jù)各自的標準曲線計算含量。結(jié)果，纖維蛋白原和凝血酶6份供試品溶液中枸櫞酸離子含量平均值分別為16.5、0.4 mmol/L， RSD 分別為0.9%、1.1%，表明本方法重復性良好。

2.2.4穩(wěn)定性實驗取豬纖維蛋白原（批號20141021）供試品溶液，室溫放置0、37 h 時，進樣測定，兩次峰面積的相對偏差為0.32%;取豬凝血酶（批號20150811）供試品溶液，室溫放置0、24 h 時，進樣測定，兩次峰面積的相對偏差為0.56%。表明纖維蛋白原和凝血酶供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5加樣回收率實驗取已知枸櫞酸離子含量樣品（豬纖維蛋白原批號20141021、F201501002，各9份;豬凝血酶批號20131213，12份），根據(jù)各自枸櫞酸離子標準限度規(guī)定，分別加入一定量的枸櫞酸對照品，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“1.3”項下實驗條件測定，根據(jù)標準曲線計算加樣回收率，見表2。

2.3樣品枸櫞酸離子含量測定

取豬纖維蛋白原樣品8批、豬凝血酶樣品6批，分別按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“1.3”項下實驗條件進樣測定，每批平行測定2份供試品溶液，根據(jù)標準曲線計算其中枸櫞酸離子含量，見表3。

3討論

豬源纖維蛋白粘合劑在臨床上應用日益廣泛，需控制其中的枸櫞酸含量，以期獲得更好的止血效果。現(xiàn)行質(zhì)量標準均采用比色法，通過檢測枸櫞酸與吡啶、醋酐生成的紫紅色溶液吸光度大小來反映枸櫞酸離子含量[5]，其操作過程繁瑣，而且需要用到吡啶、醋酸酐、三氟乙酸等有毒或刺激性試劑，對實驗人員身體有害。因此，有必要建立新的方法測定豬源纖維蛋白粘合劑中的枸櫞酸離子含量。本研究采用高效液相色譜法進行測定，實驗結(jié)果令人滿意。與現(xiàn)行標準的“比色法”相比較，高效液相色譜法的實驗過程操作較為簡便，不需要用到有毒試劑，而且準確性高，專屬性強，重復性好。

枸櫞酸為三元有機酸，在色譜柱中的保留較難洗脫。預實驗時選用18.2 mmol/L 磷酸、磷酸二氫鈉（pH 2.0）[16]-0.1%異丙醇溶液作為流動相，結(jié)果顯示，枸櫞酸峰與相鄰色譜峰的分離度較差。于是調(diào)整流動相為18 mmol/L 的磷酸二氫鈉-0.1%異丙醇溶液，再用磷酸調(diào) pH 值至2.0，使用 C18水相柱，此時枸櫞酸較快出峰，出峰的峰型好，塔板數(shù)高。雖然不同企業(yè)產(chǎn)品中的輔料不同，但由色譜圖中可看出其他成分均可與枸櫞酸峰達到基線分離，不干擾其測定。

枸櫞酸為紫外末端吸收，選擇210 nm 波長檢測既能夠減少溶劑及流動相干擾，又保證有足夠響應值，進行定量檢測。

由于國內(nèi)2家企業(yè)生產(chǎn)的豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶的枸櫞酸離子含量差別較大，因此采用了標準曲線法來同時測定2家企業(yè)的產(chǎn)品，當只有1家企業(yè)樣品時，也可采用外標法來測定。

本研究采用 HPLC 法檢測豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶兩種成分的枸櫞酸離子含量，操作簡便，精密度、重復性、穩(wěn)定性好，可更好地控制該藥品的質(zhì)量。

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（收稿日期：2021-03-30）