陳文芳，桂文龍，顏 衛(wèi)，孟欣欣，錢(qián)逸雪，霍英卓，蔣志偉

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

骨骼透明標(biāo)本的制作過(guò)程受多種因素的影響，近年來(lái)對(duì)動(dòng)物骨骼透明標(biāo)本的制作和應(yīng)用越來(lái)越廣泛，制作方法也層出不窮，但對(duì)其制作過(guò)程的條件探討很少，本試驗(yàn)通過(guò)采用茜素紅單染色法探討不同的室溫和不同的堿液濃度對(duì)小脊椎動(dòng)物骨骼透明標(biāo)本制作效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小脊椎動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用活體小脊椎動(dòng)物（蛙類(lèi)、幼鼠、魚(yú)類(lèi)）均由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 氫氧化鉀、無(wú)水乙醇，丙酮（分析純，濃度為99.7%），丙三醇（分析純，濃度為99.0%），茜素紅，蒸餾水。

1.1.3 器材 解剖器械、燒杯、量筒、膠頭滴管、玻璃棒、托盤(pán)天平、廣口瓶、標(biāo)本瓶。

1.2 溶液配制 Y1 系列：將無(wú)水乙醇和蒸餾水分別按70%、80%、90%、100%的濃度梯度配制。

Y2 系列：將氫氧化鉀和蒸餾水分別按1%KOH、2%KOH、3%KOH的濃度配制。

Y3：茜素紅0.01 g，KOH 1.0 g，蒸餾水100 mL，混合均勻。

Y4：丙三醇20 mL，KOH 1.0 g，蒸餾水80 mL，混合均勻。

Y5 系列：將丙三醇和蒸餾水分別按50%、75%、100%的濃度梯度配制。

1.3 方法

1.3.1 選材分組 分別在冬、春季和夏季不同室溫條件下，選擇活體牛蛙（200 g 左右）、出生一周內(nèi)的幼鼠、15～20 cm 長(zhǎng)的鯽魚(yú)和成年觀賞金魚(yú)四種小脊椎動(dòng)物各12只，隨機(jī)均分成3組，每組4只，按不同的溶液濃度分別操作。

1.3.2 標(biāo)本預(yù)處理 將新鮮完整的活體小動(dòng)物分別進(jìn)行預(yù)處理。蛙類(lèi)用金屬探針插入活體枕骨大孔，破壞腦脊髓處死，在腹部正中位置切開(kāi)小口去除內(nèi)臟，將標(biāo)本沖洗干凈；魚(yú)刮去鱗片，打開(kāi)腹腔去除內(nèi)臟，清洗干凈；出生一周內(nèi)的小鼠，用乙醚麻醉后，打開(kāi)腹腔取出內(nèi)臟，清洗干凈。

1.3.3 固定 將預(yù)處理好的標(biāo)本放入95%酒精中固定，以確保標(biāo)本的良好形態(tài)，魚(yú)標(biāo)本用線綁在玻璃片上，使它的姿勢(shì)呈自然狀態(tài)。液面沒(méi)過(guò)標(biāo)本，并將標(biāo)本盡可能伸展，隨時(shí)觀察固定情況，直到標(biāo)本骨骼稍硬、可隨意翻動(dòng)為止。

1.3.4 脫水 將標(biāo)本依次浸泡在80%、90%、100%的Y1系列溶液中，每種濃度溶液浸泡3～7 d。

1.3.5 脫脂 根據(jù)標(biāo)本實(shí)際情況選擇脫脂，將脫水后的標(biāo)本在丙酮內(nèi)脫去脂肪，時(shí)間為2～4 d，中間換液1次。

1.3.6 透明 把脫水的標(biāo)本放入Y2 系列溶液中進(jìn)行初步的腐蝕透明，隨時(shí)觀察透明情況，中間可根據(jù)標(biāo)本情況更換一次腐蝕軟化透明液，直到標(biāo)本呈半透明狀態(tài)、能隱約看到骨骼時(shí)為止。

1.3.7 染色 把初步半透明的標(biāo)本放入Y3 溶液中浸泡，使茜素紅著色于骨骼。在浸泡過(guò)程中隨時(shí)觀察著色情況，直到骨骼染成紫紅色為止。著色快慢與標(biāo)本情況有關(guān)。

1.3.8 初步脫色 將標(biāo)本從Y3 溶液中取出放置于Y4 溶液中浸泡，使染色的軟組織脫色變成白色，直到骨不變色為止。

1.3.9 深度脫色 將標(biāo)本從Y4 溶液中依次放置于Y5系列梯度脫色液中，逐步繼續(xù)脫色，使軟組織逐漸變?yōu)闊o(wú)色，直到骨組織清晰可見(jiàn)為止。脫色過(guò)程中根據(jù)脫色液的渾濁程度決定是否更換更高濃度的脫色液。

1.3.10 保存 將脫色好的標(biāo)本放入純甘油（丙三醇）中保存。

2 結(jié)果

2.1 堿溶液濃度的影響 在標(biāo)本染色前的處理中，不同的KOH溶液濃度對(duì)標(biāo)本腐蝕軟化透明的時(shí)間有較大的影響，如表1所示。

表1 不同的KOH濃度對(duì)小動(dòng)物骨骼軟化透明效果的影響（室溫5～20 ℃）

從表1可以看出，在相同的環(huán)境溫度下，同一小脊椎動(dòng)物在不同的KOH 濃度中達(dá)到軟組織呈半透明狀態(tài)、隱約看到骨骼的理想效果，在時(shí)間上有較大的差距。隨著溶液濃度的增加，每種動(dòng)物軟化透明的速度加快。

2.2 環(huán)境溫度的影響 在標(biāo)本的處理、染色和脫色過(guò)程中，環(huán)境溫度均對(duì)其制作時(shí)間有較明顯的影響，如圖1～圖4所示。

圖1 不同室溫對(duì)標(biāo)本固定時(shí)間的影響（d）

圖2 不同室溫對(duì)標(biāo)本染色時(shí)間的影響（d）

圖3 不同室溫對(duì)標(biāo)本脫色時(shí)間的影響（d）

圖4 不同室溫對(duì)標(biāo)本透明時(shí)間的影響（d）

在較低的氣溫條件下，幾種小脊椎動(dòng)物標(biāo)本固定、染色、脫色和透明制作環(huán)節(jié)的時(shí)間都比較長(zhǎng)，隨著室溫升高，制作時(shí)間均明顯縮短。同等條件下體積最大的鯽魚(yú)在不同室溫下的制作時(shí)間最長(zhǎng)，體積最小的金魚(yú)制作時(shí)間最短，蛙和仔鼠的制作時(shí)間介于鯽魚(yú)和金魚(yú)之間。故正常室溫條件下，溫度越高標(biāo)本制作時(shí)間越短，體積越大標(biāo)本制作時(shí)間越長(zhǎng)。

3 討論

3.1 試劑選擇 本試驗(yàn)在試劑的選擇上選用了成本低、對(duì)人體傷害小、效果較好的試劑，如在固定環(huán)節(jié)選用酒精固定液，因?yàn)榫凭哂惺共牧嫌不兔撝碾p重作用［1］；在染色前選用梯度濃度酒精和丙酮進(jìn)行脫水脫脂處理［2］；選用既能軟化透明軟組織又能增加染料滲透力的KOH 堿液［3］；選用對(duì)骨骼染色有特異性的茜素紅染色劑［4］；透明劑則選用低成本又無(wú)毒的甘油［5］。

3.2 材料預(yù)處理 在標(biāo)本的預(yù)處理中動(dòng)物的剝皮與否取決于標(biāo)本制作時(shí)間快慢的選擇，本試驗(yàn)為了保持標(biāo)本的整體輪廓沒(méi)有做剝皮處理，標(biāo)本整體效果較好。標(biāo)本預(yù)處理時(shí)應(yīng)注意保持標(biāo)本的完整性，尤其不要損害骨骼。

3.3 堿液濃度選擇 低濃度的堿液提高了組織的通透性，使染色液和甘油的滲透力增強(qiáng)。但在濃度的選擇上應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，一方面氫氧化鉀堿液具有腐蝕作用，隨意提高濃度會(huì)使標(biāo)本受到破壞，因此堿液濃度要從低至高逐步增加；另一方面采用較高濃度的氫氧化鉀堿液軟化，其間必須隨時(shí)嚴(yán)格觀察，以免短時(shí)間內(nèi)腐蝕過(guò)度而破壞組織。在軟化透明過(guò)程中要注意觀察不能透明過(guò)久，否則肌肉會(huì)腐蝕過(guò)度，變軟甚至離散。

3.4 效果判斷方法 選用眼觀變化比較明顯的環(huán)節(jié)，如在標(biāo)本固定環(huán)節(jié)可以直接觀察和觸碰其固定效果，在軟化透明環(huán)節(jié)可以觀察標(biāo)本的肌肉膨脹透明程度，在染色環(huán)節(jié)可以觀察骨骼的染色程度，在脫色環(huán)節(jié)可以觀察軟組織的脫色情況等。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)分別在我國(guó)東南部的冬、春、夏三個(gè)季節(jié)自然氣候條件下進(jìn)行，通過(guò)對(duì)幾種小脊椎動(dòng)物的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)氣溫較高的夏季，骨骼透明標(biāo)本的制作時(shí)間明顯較短，染色效果也較好，而冬季每一步操作的時(shí)間都延長(zhǎng)，染色效果一般。

不同的標(biāo)本有不同的最佳堿液濃度，1%KOH溶液適用于體積很小、軟組織較少的標(biāo)本，3%KOH 溶液適用于軟組織較厚、體積較大的標(biāo)本，而濃度大于3%的氫氧化鉀溶液不適用于組織的軟化透明。本試驗(yàn)得出：鯽魚(yú)標(biāo)本選擇3%KOH、金魚(yú)標(biāo)本選擇1%KOH，而仔鼠和蛙標(biāo)本選擇2%KOH較為合適。

動(dòng)物骨骼透明標(biāo)本的制作周期、標(biāo)本質(zhì)量及觀察效果除了受環(huán)境溫度、動(dòng)物體質(zhì)量、堿性試劑濃度等關(guān)鍵因素的影響外，標(biāo)本最終的染色效果還與固定液濃度和時(shí)間、脫水脫脂液濃度等密切相關(guān)，同時(shí)受動(dòng)物年齡大小、動(dòng)物體型大小、環(huán)境濕度等因素的直接影響。