郝文娟 沈志森 周重昌 李群 鄧紅霞

喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）占喉癌的96%以上，是頭頸癌中最常見的惡性腫瘤之一[1]。根據我國癌癥統(tǒng)計數據，2015年喉癌新增患者約26 300例，死亡14 500例[2]，且喉癌發(fā)病率男性明顯多于女性（比例約為4∶1）[3-4]?；顧z病理結果是LSCC診斷的金標準，CT、MRI和PET用于腫瘤分期。但喉癌的初期癥狀容易被忽視，如聲音嘶啞、發(fā)聲困難、呼吸困難等，60%的患者在確診時已處于晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[5]。由于喉的特殊解剖結構和不可替代的功能，術后發(fā)聲困難、吞咽困難和永久性氣管造瘺對患者的生活質量有重要影響[6]。研究人員致力于尋找無創(chuàng)的診斷和治療方法。有報道稱長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在LSCC的發(fā)生、發(fā)展和轉移中起關鍵作用[7]。lncRNA定義為一類長度超過200 bp且不編碼蛋白的轉錄本，在腫瘤中的差異表達可能是腫瘤診斷和預后評估的生物標志物[8]。筆者團隊發(fā)現lncRNA RP11-169D4.1-001在LSCC腫瘤組織中表達下調[9]。不僅如此，RP11-169D4.1001表達下調與患者頸淋巴結轉移、預后和生存時間顯著相關[9]。本研究進一步通過細胞實驗來探討RP11-169D4.1-001對LSCC細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞來源和培養(yǎng) 本實驗使用兩株LSCC細胞，其中AMC-HN-8購自蘇州北納保藏中心，使用含10%FBS的DMEM（高糖）培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；TU-212購自廣州基迪奧生物科技公司，使用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱。當貼壁細胞融合度約達90%以上時，給予細胞傳代處理，以防細胞之間發(fā)生接觸抑制。棄去培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)基，加入2 ml PBS漂洗2～3遍。棄去PBS，再加入適量的含0.25%EDTA的胰蛋白酶，使其完全覆蓋瓶底。將培養(yǎng)瓶放置于細胞培養(yǎng)箱中，待細胞變圓、開始從瓶底脫落的時候，加入2 ml完全培養(yǎng)基終止消化。用吹打管將少許黏附在瓶底的細胞吹落，并將細胞團吹散制成單細胞懸液。取適量細胞懸液放入新的培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基。瓶體標明細胞名稱及傳代時間，繼續(xù)放置在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.2 細胞轉染 過表達RP11-169D4.1-001的慢病毒載體LV5-RP11-169D4.1-001及其空載對照LV5-NC購自中國吉瑪公司，滴度高達5×108TU/ml。根據細胞復染指數，向細胞培養(yǎng)基中加入適量體積的病毒液，并使用聚凝胺（5 μg/ml）促進病毒轉染的效率，放在水平搖床上將板內溶液混合均勻。經轉染，AMC-HN-8和TU-212細胞均分為穩(wěn)定過表達RP11-169D4.1-001的LV5-RP11-169D4.1-001組及其對照LV5-NC組，將兩組細胞株置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.3 轉染后LSCC細胞RP11-169D4.1-001表達水平檢測 采用qRT-PCR法。細胞的總RNA使用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取。采用DS-11 Plus分光光度計（美國丹諾爾公司）測定總RNA濃度，A260/A280和A260/A230的比值判斷提取RNA的純度。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。取2 μg總RNA，用GoScriptTM逆轉錄系統(tǒng)試劑盒（美國Promega公司）進行逆轉錄反應。以逆轉錄得到的cDNA為模板，與GoTaqqPCR Master Mix試劑盒（美國Promega公司）和引物反應，檢測目的基因水平。所有反應均在Mx3005P QPCR系統(tǒng)（美國Stratagene公司）上進行，RP11-169D4.1-001的相對表達水平通過GAPDH進行標準化。引物由上海生工生物技術有限公司合成，RP11-169D4.1001引物序列：正義鏈 5'-TCTCACTAAGGTAGAACTGATGGGC-3'，反義鏈5'-GACTCCTCAGGGAAAATGGAAACT-3'；GAPDH 正義鏈 5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'，反義鏈 5'-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3'。

1.4 轉染后LSCC細胞增殖及細胞克隆形成實驗 采用實時細胞分析儀（美國艾森生物科學公司）檢測RP11-169D4.1-001對LSCC細胞增殖的影響。96 h實時監(jiān)測細胞指數（cell index,CI）以評估細胞增殖率。采用細胞克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成率，將細胞接種于6孔板（1 000細胞/孔）；14 d后，使用4%多聚甲醛固定菌落，0.1%結晶紫染色，拍照，計數。細胞的克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.5 轉染后LSCC細胞周期與凋亡分析 將細胞接種于6孔板。細胞附著后，將完全培養(yǎng)基改為無血清培養(yǎng)基，使G0期細胞周期同步。細胞饑餓24 h后換回完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后收集細胞，使用周期試劑盒（杭州聯科公司）進行染色，FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）分析樣本。每個樣本獲取20 000個細胞，使用Modifit軟件（美國BD公司）分析細胞周期的分布。細胞凋亡分析用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(杭州聯科公司)進行染色。使用FlowJo 7.6.1軟件分析流式細胞儀檢測的細胞凋亡譜。

1.6 轉染后LSCC細胞遷移實驗 使用劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞的遷移能力。劃痕實驗時將細胞接種于培養(yǎng)皿中，其融合度達到90%以上時用吸管頭劃痕，并換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，根據劃痕面積計算相對遷移率，用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）測量劃痕面積。Transwell實驗時下室加入完全培養(yǎng)基，上室接種無血清培養(yǎng)基；24 h后用4%多聚甲醛固定在膜上，然后用0.1%結晶紫（德國Sigma公司）染色并在顯微鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。實驗至少獨立重復3次。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染不同慢病毒載體LSCC細胞RP11-169D4.1-001表達水平比較 在AMC-HN-8和TU-212兩株LSCC細胞中，LV5-RP11-169D4.1-001組 RP11-169D4.1-001表達水平均顯著高于LV5-NC組，見圖1。

圖1 轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞RP11-169D4.1-001相對表達水平比較（與LV5-NC組比較，***P＜0.001）

2.2 轉染不同慢病毒載體LSCC細胞增殖能力和克隆形成率比較 細胞增殖實驗顯示，與LV5-NC組細胞相比，RP11-169D4.1-001組細胞增殖能力下降（P＜0.05），細胞生長曲線見圖2。細胞克隆形成實驗顯示，與LV5-NC組細胞相比，RP11-169D4.1-001組細胞克隆形成率下降（P＜0.05），見圖 3（插頁）、4。即 RP11-169D4.1-001在LSCC細胞增殖和細胞克隆形成中發(fā)揮抑制作用。

圖2 轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞生長曲線比較（與 LV5-NC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

圖3 兩組喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞克隆形成后肉眼所見（0.1%結晶紫染色，×1）

圖4 轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞克隆形成率比較（與 LV5-NC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 轉染不同慢病毒載體LSCC細胞周期分布與凋亡情況比較 流式細胞術分析結果顯示，RP11-169D4.1-001組細胞周期阻滯在G0/G1期，S期占比下降，見圖5。其中S+M期占比可代表細胞的增殖率，可見RP11-169D4.1-001抑制細胞增殖。細胞凋亡實驗顯示，RP11-169D4.1-001組細胞凋亡率高于LV5-NC組（P＜0.05），見圖6。

圖5 轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞各期細胞占比比較（與 LV5-NC 組比較，**P＜0.01，***P＜0.001）

圖6 轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞凋亡率比較（與 LV5-NC 組比較，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.4 轉染不同慢病毒載體LSCC細胞遷移能力比較 劃痕實驗顯示，兩株細胞株中RP11-169D4.1-001組細胞遷移率均低于LV5-NC組（P＜0.05），見圖7。Transwell實驗得出了與劃痕實驗一致的結論。與LV5-NC組相比，RP11-169D4.1-001組細胞遷移到下室的細胞數量顯著減少（P＜0.05），見圖 8（插頁）、9。

圖7 劃痕實驗檢測轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞遷移能力[a：細胞劃痕圖片（×40）；b：細胞遷移率比較；與LV5-NC組比較，**P＜0.01，***P＜0.001]

圖8 Transwell實驗檢測轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞穿越Transwell小室后圖片（0.1%結晶紫染色，×100）

圖9 Transwell實驗檢測轉染不同慢病毒載體喉鱗狀細胞癌（LSCC）細胞每視野下細胞數比較（與LV5-NC組比較，***P＜0.001）

3 討論

lncRNA是長度超過200 bp的非編碼RNA，具有差異性表達的特性，在疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。lncRNA具有多種生物學功能，如調控基因的表達、核組織和核區(qū)隔化、細胞核-質運輸等[10]。然而，目前尚不清楚lncRNA表達的變化是疾病發(fā)生的原因還是結果。其中，基因間長鏈非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA,lincRNA）是一種位于基因間區(qū)域的lncRNA，它可以參與調控腫瘤的發(fā)生[12-13]。lincRNA HOTAIR（Homeobox transcript antisense RNA）、lincRNA-p21等已被鑒定為腫瘤發(fā)生和進展中的啟動子或抑制子。例如，lincRNA HOTAIR在多種腫瘤中均顯著過表達[14-15]。Gupta等[14]發(fā)現HOTAIR在原發(fā)性乳腺惡性腫瘤和轉移腫瘤組織中表達上調，通過與多梳抑制復合體2相互作用增加了腫瘤的侵襲性和轉移性。Li等[16]研究發(fā)現HOTAIR在LSCC中的表達水平明顯高于相應的鄰近非腫瘤組織，提示HOTAIR在LSCC中的致癌作用與促進人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN）甲基化有關。

RP11-169D4.1-001又名linc01537-201，長度為2450 nt。在之前的研究中，筆者團隊構建了完整的喉癌lncRNA芯片數據庫，芯片結果顯示RP11-169D4.1-001在喉癌組織中表達上調。然而，通過擴大樣本量發(fā)現，在87對配對的LSCC樣本中RP11-169D4.1-001水平顯著下調（66/87）。此外，通過臨床相關因素分析結果表明，喉癌中RP11-169D4.1-001表達水平的降低與喉癌患者的頸部淋巴結轉移和生存時間顯著相關[9]。提示RP11-169D4.1-001可能在LSCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑制作用。

為了研究RP11-169D4.1-001是否在LSCC中發(fā)揮作用，本研究利用RP11-169D4.1-001慢病毒顆粒上調了RP11-169D4.1-001在LSCC細胞中的表達水平。用嘌呤霉素和綠色熒光蛋白篩選穩(wěn)定表達的細胞株，并通過qRT-PCR分析驗證RP11-169D4.1-001的上調效果。然后本研究采用實時細胞分析、細胞克隆形成實驗進一步驗證RP11-169D4.1-001的細胞生物學功能。結果顯示高表達RP11-169D4.1-001可以抑制細胞增殖的能力和克隆形成能力。此外，流式細胞周期檢測結果顯示，高表達RP11-169D4.1-001將細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制細胞進入S期。流式細胞凋亡檢測結果顯示，RP11-169D4.1-001組細胞凋亡率明顯高于LV5-NC組，表明RP11-169D4.1-001可促進LSCC細胞凋亡。此外，本研究發(fā)現了RP11-169D4.1-001在LSCC遷移中的作用。通過劃痕實驗和Transwell遷移實驗顯示，高表達RP11-169D4.1-001顯著抑制了LSCC細胞的遷移能力。

綜上所述，RP11-169D4.1-001在LSCC細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為中發(fā)揮抑癌作用，有望成為喉癌治療的分子靶標，但其具體發(fā)揮作用的機制還有待進一步研究。