權(quán)明明 陳珍珍 王毅超

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，它常見的病理類型有4種，分別為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的病理類型[1]。雖然甲狀腺乳頭狀癌是預(yù)后良好的惡性腫瘤，但臨床上仍有部分甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后欠佳[2]。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2（epithelial cell transforming 2,ECT2）基因是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列基因的一種，已經(jīng)證實(shí)其是一種原癌基因，在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)[3-4]。臨床上對(duì)于ECT2基因在甲狀腺癌中的表達(dá)研究報(bào)道不多。基于此，本研究分析ECT2在甲狀腺乳頭狀癌的表達(dá)情況，以期為甲狀腺乳頭狀癌早期診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織均取自2020年5至12月于臺(tái)州市中心醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本，且所有標(biāo)本獲取均經(jīng)患者知情同意，患者術(shù)前均未行化療、放療、內(nèi)分泌治療，病理結(jié)果均經(jīng)2位病理科醫(yī)生判讀。甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本35例，患者男 5 例，女 30 例，年齡 32～57（44.5±1.92）歲；結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織標(biāo)本32例，患者男7例，女25例，年齡31～67（48.7±1.37）歲。兩種組織標(biāo)本患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。術(shù)后所有標(biāo)本一半立即存入-80℃冰箱，一半立即置于甲醛溶液中固定，取材體積均約5 mm×5 mm×5 mm。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2021L02-16）。

1.1.2 主要試劑和儀器 ECT2基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Trizol RNA提取試劑購自美國Invitrogen 公司（批號(hào)：15596026）；Real Maste rMix（SYBR Green）試劑盒購自日本 TakaRa公司（批號(hào)：RR066A）；ECT2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司（批號(hào)：1627591），DAB顯色試劑盒購自美國BD公司（批號(hào)：550880），PCR 儀為美國 ABI公司產(chǎn)品（型號(hào)：Stepone），垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ECT2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。設(shè)計(jì)ECT2基因引物，取存于-80℃冰箱中的甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，剪碎，每例標(biāo)本重約 80 mg，采用 Trizol提取細(xì)胞中總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280=1.8～2.0，并在1%瓊脂糖凝膠電泳中顯示出清晰的28 S和18 S兩條rRNA帶，證明提取的RNA完整。cDNA合成反應(yīng)體系：取 2 g RNA ，加 2 μl×RT mix（終濃度為 1×），2 μl dNTP混合液（終濃度為 0.25 mmol/L/dNTP），2 μl Oligo-dT15（終濃度為 1 μmol/L），1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，加 RNase Free ddH2O 至終體積20 μl，于 37℃孵育 60 min。采用SYBR Green熒光染料，參照試劑盒說明完成RT-PCR，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 1.5 min，95℃ 15 s、65℃30 s、68 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)；最后 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃15 s收集熒光信號(hào)，進(jìn)行熔解曲線分析，以結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織為參照，反應(yīng)結(jié)束由系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果。

1.2.2 ECT2蛋白表達(dá)定性檢測(cè) 采用免疫組化法。分別取甲醛溶液浸泡的甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，置于恒溫烤箱中60℃烘烤20 min，將組織玻片依次放入二甲苯溶液浸泡15 min脫蠟，再經(jīng)不同梯度乙醇（100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇）和ddH2O各5 min水化。將合適的抗原修復(fù)緩沖液（枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0）加入高壓鍋內(nèi)煮沸，將組織切片置于抗原修復(fù)沸水緩沖液中進(jìn)行高壓修復(fù)抗原，電爐加熱10 min后去除熱源，打開高壓鍋鍋蓋，利用涼水冷卻10 min，冷卻完成后PBS洗滌2遍，各5 min。因組織切片中可能含有大量的具有活性的過氧化物酶，本研究選擇滴加3%的雙氧水室溫靜置10 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，以防對(duì)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生不良影響，反應(yīng)結(jié)束后PBS洗滌2次各5 min。取出并擦干組織切片，滴加10%的山羊血清封閉液在玻片上，室溫封閉0.5～1 h，以減少非特異性結(jié)合造成的染色。結(jié)束后PBS洗滌2遍，各5 min。一抗孵育：取出玻片并擦去多余液體，滴加實(shí)驗(yàn)所需的ECT2抗體（1∶200），置于濕盒中4℃冰箱孵育過夜。第2天取用前需先甩干，并用PBS充分洗滌3次，每次5 min。二抗孵育：洗凈后每片滴加50 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，在室溫孵育30～60 min，PBS洗滌，每次5 min，重復(fù)共3次。DAB顯色：滴加現(xiàn)配的DAB顯色劑，于顯微鏡下掌握染色程度，可用自來水沖洗終止反應(yīng)。復(fù)染：蘇木精復(fù)染1～2 min，并用PBS洗凈。脫水透明：依次放入不同梯度乙醇各5 min脫水，最后放置于二甲苯溶液各5 min進(jìn)行透明處理。封片：用滴管吸取中性樹膠進(jìn)行封片操作，待玻片樹膠凝固后，顯微鏡觀察結(jié)果并拍照分析目的蛋白表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以陽性細(xì)胞所占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比和細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比按＜5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%和≥75%依次計(jì)分為 0、1、2、3和 4分，所記得分≤1分為陰性表達(dá)，≥2分為陽性表達(dá)。

1.2.3 ECT2蛋白表達(dá)定量檢測(cè) 采用Western blot法。分別取-80℃冰箱中的甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，每例約80 mg，加入組織蛋白提取液，冰上研磨，蛋白提取按試劑說明書進(jìn)行，吸取上清液。每例標(biāo)本取20 μl用BCA法測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)曲線計(jì)算電泳所需蛋白，配置10%濃縮膠和5%的分離膠，上樣量每孔為 50 μg，標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker為 5 μl，80～120 V電泳，恒壓10 V 1 h轉(zhuǎn)膜至硝基纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗2 ml（ECT2抗體濃度1∶1 000）4℃冰箱過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，濃度為1∶5 000）室溫靜置 1.5 h，ECL發(fā)光液滴加。暗室曝光顯影定影，計(jì)算機(jī)軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2 mRNA表達(dá)水平比較 相對(duì)于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，ECT2 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)水平為2.4327±0.0127，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。即甲狀腺乳頭狀癌組織ECT2 mRNA表達(dá)上調(diào)。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)陽性率比較 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)情況見圖1（插頁）。甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)陽性率分別為 57.1%（20/35）、6.3%（2/32），甲狀腺乳頭狀癌組織表達(dá)陽性率明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2（ECT2）蛋白表達(dá)定性觀察（免疫組化染色，×40）

2.3 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)水平比較 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達(dá)水平分別為1.6542±0.0159、0.4826±0.0513，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。即相對(duì)于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，甲狀腺乳頭狀癌組織ECT2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，見圖2。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2（ECT2）蛋白表達(dá)電泳圖比較（1、2：甲狀腺乳頭狀癌組織；3、5：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織；4：內(nèi)參蛋白）

3 討論

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率逐年提高，尤其是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率日益增高，甲狀腺癌發(fā)病率約占惡性腫瘤發(fā)病率的1%，發(fā)達(dá)國家高于發(fā)展中國家[5-7]。甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與癌基因突變、碘劑量、電離輻射、遺傳等因素有關(guān)，并且甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病與多個(gè)基因相關(guān)。

ECT2基因是一種鳥苷酸交換因子，研究證實(shí)其與多種惡性腫瘤發(fā)病相關(guān)，在人類染色體定位于3q26，進(jìn)化上高度保守，已經(jīng)被確定為原癌基因。ECT基因N端有兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域XCCR1和Clb6，在細(xì)胞周期調(diào)控及免疫應(yīng)答上發(fā)揮作用，通過對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，可以動(dòng)態(tài)控制腫瘤的生長[8-11]。ECT2基因在惡性腫瘤發(fā)展中起重要作用，在一項(xiàng)對(duì)肺癌的研究中，高表達(dá)的ECT2與肺癌轉(zhuǎn)移的晚期和更深的腫瘤侵襲相關(guān)[10]。此外，ECT2高表達(dá)的肺癌患者總生存期明顯短于ECT2低表達(dá)的肺癌患者，Cox回歸分析顯示，ECT2表達(dá)是總生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[12]。在胃癌中也有類似的發(fā)現(xiàn)，ECT2在胃癌中表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，高表達(dá)ECT2的胃癌，其增殖能力及侵襲能力也逐步增強(qiáng)，并且這種上調(diào)與腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)[9]。在胰腺癌組織中，與對(duì)照組相比ECT2蛋白同樣高表達(dá)，ECT2的表達(dá)量與胰腺癌的惡性程度、病例分期密切相關(guān)，數(shù)據(jù)分析表明ECT2基因是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子[13]。在一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)采用免疫組化、細(xì)胞遷移、異種移植方法檢測(cè)ECT2在乳腺癌中的表達(dá)情況，ECT2在物理上與泛素特異性蛋白酶USP7相互作用，并在功能上促進(jìn)USP7分子間自結(jié)合，支持將ECT2/USP7作為乳腺癌干預(yù)的潛在靶點(diǎn)[14]。而在另外一項(xiàng)研究中，采用構(gòu)建慢病毒ECT2過表達(dá)和干擾質(zhì)粒用于體外檢測(cè)。采用CCK-8等方法評(píng)價(jià)ECT2表達(dá)對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系的影響，ECT2是乳腺癌細(xì)胞生長的主要驅(qū)動(dòng)因子，在調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌生長中起著重要作用。PTX治療在沉默ECT2后顯著改善療效。這一發(fā)現(xiàn)提示，抑制ECT2的表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌治療的新方案，并為開發(fā)新的靶向藥物替代紫杉醇治療乳腺癌提供理論依據(jù)[15]。同樣一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究中證實(shí)ECT2是乳腺癌不良預(yù)后的因子[16-17]。關(guān)于一項(xiàng)肝細(xì)胞癌的研究中，ECT2高表達(dá)被發(fā)現(xiàn)是肝細(xì)胞肝癌的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，發(fā)現(xiàn)ECT2過表達(dá)增加了肝癌細(xì)胞的遷移和增殖，ECT2可能通過增強(qiáng)有氧糖酵解和抑制免疫細(xì)胞功能來促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的極化。ECT2可作為肝細(xì)胞肝癌的候選診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[18]。

本研究結(jié)果表明ECT2在甲狀腺乳頭狀癌組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織均表達(dá)，結(jié)果采用相對(duì)定量方法計(jì)算，ECT2基因在甲狀腺乳頭狀癌組織相對(duì)于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織的表達(dá)量為2.4327±0.0127，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，在甲狀腺乳頭狀癌組織表達(dá)陽性率明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織。這結(jié)果提示，ECT2在甲狀腺乳頭狀癌高表達(dá)，其在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因作用。關(guān)于ECT2基因研究，已經(jīng)證實(shí)在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其具體高表達(dá)的機(jī)制尚無法解釋。有研究表明ECT2基因在腦膠質(zhì)瘤中是通過泛素化發(fā)揮作用[19]，而ECT2基因作為癌基因在甲狀腺乳頭狀癌中如何發(fā)揮作用，是否與泛素化有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。也有研究證實(shí)ECT2基因在雌激素受體陽性乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌中均是預(yù)后不良的獨(dú)立因子[20-21]。筆者團(tuán)隊(duì)擬下一步在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平進(jìn)一步使用siRNA進(jìn)行調(diào)控，以期進(jìn)一步研究ECT2基因發(fā)揮癌基因的機(jī)制，為甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷、早期干預(yù)抑或腫瘤標(biāo)志物提供客觀的分子生物學(xué)依據(jù)。