李茂光，龍珍，陳瓊，李月琪，許美鳳，王春娥，李亞南，葉強

1.中國食品藥品檢定研究院，北京102629；2.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，北京100020

多糖疫苗是疫苗重要類型之一［1］，如23價肺炎球菌多糖疫苗（23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPSV-23）［2］。PPSV-23自上市以來，廣泛用于2歲以上人群的免疫，在預(yù)防肺炎球菌感染中發(fā)揮了重要作用，尤其對老年人和艾滋病患者［3］，PPSV-23是全球排名前十的高銷量疫苗品種之一。同時，多糖疫苗也是多糖蛋白結(jié)合疫苗的基礎(chǔ)，如腦膜炎球菌結(jié)合疫苗［4-5］和b型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzaetype b，Hib）結(jié)合疫苗［6］。多糖疫苗和多糖蛋白結(jié)合疫苗中的多糖生產(chǎn)過程相似［7］，去氧膽酸（deoxycholic acid，OBA）用于PPSV-23收獲液的殺菌，腦膜炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)無需該試劑，但大部分多糖疫苗和多糖蛋白結(jié)合疫苗均以十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）作為多糖純化劑。

OBA和CTAB均為弱紫外（無紫外）吸收，未經(jīng)衍生難以用紫外／可見光檢測和定量。疫苗基質(zhì)復(fù)雜，紫外／可見光檢測受基質(zhì)干擾較大，靈敏度和重復(fù)性受到較大限制。通用型檢測器可用于弱紫外化合物的直接檢測［8-9］，無須衍生，但該類檢測器靈敏度較低且受基質(zhì)干擾較大，不適合疫苗基質(zhì)中微量殘留物質(zhì)的檢測。GIRARD等［10］研發(fā)了一種固相萃取-液相色譜方法用于流感疫苗中OBA的檢測，但該方法靈敏度較低，前處理過于繁瑣，不利于普及?！吨袊幍洹啡浚?020版）采用衍生-紫外分光光度法檢測殘留的OBA［11］，但該方法無分離選擇性、易受基質(zhì)干擾，且靈敏度較低。目前未見CTAB的檢測方法相關(guān)報道。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）法兼具LC的分離能力及前體離子與產(chǎn)物離子雙重選擇性（MRM模式），可提高檢測的準(zhǔn)確度和抗基質(zhì)干擾能力，適用于快速檢測［2，12-13］。魏瑞成等［14］采用固相萃取-LCMS／MS法成功定量檢測出牛奶中殘留的CTAB。為了解多糖疫苗中CTAB和OBA的殘留情況，本研究建立采用液相分離及MRM模式的LC-MS／MS方法，并進行方法的驗證，以期用于多糖疫苗中OBA和CTAB殘留量的檢測。

1 材料與方法

1.1 對照品及樣品CTAB（57-09-0）和OBA（83-44-3）對照品購自美國Sigma公司；肺炎球菌多糖（1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型）、3批Hib粗糖及其對應(yīng)批次精糖、3批A、C、Y、W135群腦膜炎球菌粗糖及其對應(yīng)批次精糖均由中國食品藥品檢定研究院提供，其中腦膜炎球菌多糖溶液和Hib多糖溶液含糖量為5 g／L。

1.2 主要試劑及儀器 甲酸銨（MS級）及甲酸（MS級）購自美國Acros公司；乙腈（HPLC級）購自美國默克公司；三氟乙酸購自美國Sigma公司；Kinetex C18（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）色譜柱購自美國菲羅門公司；液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)購自日本島津公司。

1.3 方法的建立

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Kinetex C18（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）。流動相A：5 mmol／L甲酸銨（pH 4.0）；流動相B：乙腈，梯度：0~1.0 min 40%B，1.0~3.0 min 90%B，3.0~4.0 min 90%B，4.0~4.1 min 90%~40% B，4.1~6.0 min 40% B；柱溫：35℃；流速：0.3 mL／min；進樣體積：2 μL；進樣清洗：泵清洗（進樣前后清洗），洗針方式為清洗口+清洗泵（針內(nèi)外清洗），先清洗泵，后清洗口。清洗口清洗液：R0為50%甲醇水，R1為0.1%甲酸水溶液，R2為100 mmol／L甲酸銨水溶液（pH 4）；清洗泵清洗液R3為甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、水、三氟乙酸的混合液（體積比200∶200∶200∶200∶200∶5）。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI，正負(fù)離子同時檢測模式；霧化氣流速：3.0 L／min；干燥氣流速：10 L／min；駐留時間：30 ms；接口溫度：300℃；DL溫度：220℃；接口電壓：4.0 kV；MRM參數(shù)：CTAB檢測離子（m／z）為284.3→60.1，Q1 Pre Bias-15 V，CE-29 V，Q3 Pre Bias-24V；OBA檢測離子（m／z）為391.3→345.2和391.3→327.1，Q1 Pre Bias均為15 V，CE分別為33和35 V，Q3 Pre Bias分別為22和20 V，其中391.3→345.2為定量離子。

1.4 方法的驗證

分別稱取CTAB和OBA對照品10 mg，用50%乙腈水溶液配制成10 mg／L的對照品母液。

1.4.1 線性范圍 用50%乙腈水溶液將CTAB對照品母液配制成濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、

1.56 μg／L的對照品溶液，將OBA對照品母液配制成濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg／L的對照品溶液，采用1.3項色譜及質(zhì)譜條件進行檢測。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程，并計算R2值。

1.4.2 精密性 用50%乙腈水溶液分別將CTAB及OBA對照品母液稀釋為1.593和1.56 μg／L的對照品溶液，采用1.3項色譜及質(zhì)譜條件進行檢測，重復(fù)進樣6次，計算出峰時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.4.3 準(zhǔn)確度 分別取CTAB及OBA對照品母液100 μL，用50%乙腈水溶液稀釋至1 mL（對照）；分別取900 μL肺炎球菌多糖（1、3、4、5、6B和19A型）、腦膜炎球菌精糖（A、C群）及Hib精糖，加入100 μL 50%乙腈水（樣品）；分別取900 μL上述樣品，加入至100 μL對照品母液中（加標(biāo)樣品），采用1.3項色譜及質(zhì)譜條件進行檢測，并按下式計算回收率。

回收率（%）=（加標(biāo)樣品-樣品）／對照×100%

1.4.4 檢出限及定量限 參照ASTM法原則，即檢出限濃度目標(biāo)化合物S／N不小于3，定量限濃度目標(biāo)化合物S／N不小于10的原則確定方法的檢出限及定量限。分別取CTAB及OBA對照品母液，用50%乙腈水稀釋至1～2 μg／L，采用1.3項色譜及質(zhì)譜條件進行檢測。

1.5 方法的應(yīng)用 取23批肺炎球菌多糖（1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型）、3批Hib粗糖和精糖、3批A、C、Y、W135群腦膜炎球菌粗糖和精糖，用50%乙腈水溶液稀釋2～300倍，采用1.3項色譜及質(zhì)譜條件檢測CTAB及OBA殘留量。

2 結(jié)果

2.1 方法的驗證

2.1.1 線性范圍CTAB和OBA典型色譜質(zhì)譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。CTAB濃度在1.56～50 μg／L范圍時，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=133 056X-290 15，R2=0.999 9；OBA濃度在6.25～100 μg／L范圍時，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=250.5X-59.1，R2=0.999 7。

圖1 OBA和CTAB的色譜圖Fig.1 Chromatogram of OBA and CTAB

圖2 CTAB（A）和OBA（B）的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of CTAB（A）and OBA（B）

2.1.2 精密性O(shè)BA對照品溶液6次重復(fù)進樣檢測的保留時間和峰面積的RSD分別為0.15%和1.42%，CTAB對照品溶液6次重復(fù)進樣檢測的保留時間和峰面積RSD分別為0.16%和1.50%，均＜2%，見表1。表明該方法具有良好的精密性。

表1 精密性驗證結(jié)果Tab.1 Verification for precision

2.1.3 準(zhǔn)確度OBA和CTAB加標(biāo)回收率在91.8%～103.5%之間，均在80%～115%范圍內(nèi)，見表2。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表2 準(zhǔn)確度驗證結(jié)果（%）Tab.2 Verification for accuracy（%）

2.1.4 定量限及檢出限OBA的檢出限為1.02 μg／L（S／N=5.6），定量限為2.04 μg／L（S／N=10.2）；CTAB的定量限為1.56 μg／L（S／N=77.4）。

2.2 方法的應(yīng)用

2.2.1 肺炎球菌多糖4、9N、9V和15B型肺炎球菌多糖無明顯CTAB檢出，其他血清型均有不同程度檢出。與CTAB比較，OBA的殘留較少，甚至大部分血清型的肺炎球菌多糖中無明顯OBA檢出。見圖3（以19A和23F型為例）和表3。

表3 23種血清型肺炎球菌多糖中OBA和CTAB的殘留量（μg／L）Tab.3 Residual contents of OBA and CTAB in 23 serotypes of pneumococcal polysaccharides（μg／L）

圖3 19A（A）和23F型（B）肺炎球菌多糖中OBA和CTAB殘留量的檢測Fig.3 Determination of residual OBA and CTAB contents in pneumococcal polysaccharide of serotypes 19A（A）and 23F（B）

2.2.2 腦膜炎球菌多糖3批A、C、Y、W135腦膜炎球菌粗糖中CTAB殘留量為112.40~1 709.60 μg／L，對應(yīng)批次精糖中CTAB殘留量為0.08~43.20 μg／L，見表4。

表4 腦膜炎球菌粗糖和精糖中CTAB的殘留量Tab 4.Residual CTAB contents in crude and purified meningococcal polysaccharides

2.2.3 Hib多糖3批Hib粗糖中CTAB殘留量分別為1 265.10、1 189.00和1 513.30 μg／L，對應(yīng)批次粗糖中CTAB殘留量分別為6.50、166.60、6.65 μg／L。

3 討論

本研究建立了用于同時定量測定CTAB和OBA的快速、高選擇性和高靈敏度的LC-MS／MS方法，前期預(yù)實驗確定OBA檢測離子（m／z）為391.3→345.2和391.3→327.1，CTAB檢測離子（m／z）為284.3→60.1，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道相符［14］。CTAB等季胺型表面活性劑極易在系統(tǒng)中殘留，導(dǎo)致測試結(jié)果出現(xiàn)偏差，前期預(yù)實驗確定CTAB最易殘留的位置為進樣系統(tǒng)。因此，本實驗采用清洗泵+清洗口的清洗方式進行清洗，該方式可利用清洗泵清洗液的強清洗能力去除殘留的三氟乙酸消除洗針液對OBA檢測的影響。

本研究線性驗證結(jié)果表明，CTAB濃度在1.56～50 μg／L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=133 056X-290 15，R2=0.999 9；OBA濃度在6.25～100 μg／L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=250.5X-59.1，R2=0.999 7。OBA及CTAB對照品6次重復(fù)進樣檢測的保留時間和峰面積RSD均＜2%，表明該方法具有良好的精密性。OBA和CTAB加標(biāo)回收率均在80%～115%范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度驗證中采用的樣品分別為肺炎球菌多糖1、3、4、5、6B和19A型，涵蓋了弱酸性多糖（含有羧基，1型-三分之二糖單元含羧基、3型-二分之一糖單元含羧基、4型-四分之一糖單元含羧基、5型-五分之一糖單元含羧基）和中強酸性多糖（含有磷酸基團，6B型-四分之一糖單元含磷酸基團、19A型-三分之一糖單元含磷酸基團），用這些典型的樣品代替全部樣品進行驗證。OBA的檢出限為1.02 μg／L，定量限為2.04 μg／L；受CTAB殘留影響，無法測試CTAB的檢出限和定量限，本研究以不干擾CTAB線性測試的最低濃度1.56 μg／L作為CTAB的方法定量限。采用低殘留進樣系統(tǒng)和獨特的洗針方式后，CTAB的殘留較小，與已報道的LC-MS／MS定量法比較［15］，靈敏度有所提升，且無需復(fù)雜前處理步驟。

肺炎球菌多糖中OBA和CTAB定量檢測結(jié)果顯示，除4、9N、9V和15B型多糖無明顯CTAB檢出外，其他型別均有不同程度檢出，其中3型肺炎球菌多糖CTAB的含量高達(dá)12.1 mg／L。不同血清型多糖純化工藝中CTAB的添加量及后續(xù)純化步驟的差異均會導(dǎo)致最終CTAB殘留量的不同。從結(jié)構(gòu)分析，3型多糖疫苗中50%以上糖單元含有羧基，4、9N、9V和15B型多糖疫苗結(jié)構(gòu)中，負(fù)電荷基團所占比例均較低（摩爾比為1／4～1／5）。負(fù)電荷基團（如羧基）越多表明與CTAB的結(jié)合率越高，可能是導(dǎo)致不同血清型多糖疫苗中CTAB殘留量不同的原因之一。另外，CTAB易在系統(tǒng)中殘留，若使用CTAB進行純化多糖的容器清洗不充分，該容器在承裝其他不采用CTAB純化的多糖時，可能會造成CTAB污染。本實驗中肺炎球菌多糖除3型以外，其他多糖未采用CTAB純化，但在多種多糖中均有不同程度CTAB檢出，推測可能由于容器去除CTAB不徹底所致。與CTAB比較，OBA的殘留較少，甚至大部分血清型的多糖疫苗中無明顯OBA檢出。其原因可能為：OBA的添加量較少；OBA在多糖疫苗工藝中最早添加（培養(yǎng)終止時即已添加），后續(xù)純化工藝中添加的試劑（如CTAB、乙醇和丙酮）均可去除殘留的OBA。腦膜炎球菌粗糖樣品中，同血清型樣品的殘留CTAB含量差異可反應(yīng)純化工藝的差異和批間穩(wěn)定性，3批腦膜炎球菌粗糖和對應(yīng)批次精糖均有不同程度的CTAB檢出。與粗糖比較，各血清型精糖樣品中CTAB的含量均有大幅降低，均＜50 μg／L，按雜質(zhì)含量百分比計算不足0.001%，表明精制步驟可有效去除CTAB。3批Hib多糖的粗糖中CTAB殘留量為1 100～1 600 μg／L，精糖中CTAB殘留量顯著降低，精制步驟可有效去除CTAB。雖然精制多糖中殘留CTAB占產(chǎn)品質(zhì)量百分比不到0.004%，但第2批CTAB殘留量顯著高于1和3批，一定程度上反應(yīng)了純化工藝穩(wěn)定性尚有提升空間。

綜上所述，本研究建立的LC-MS／MS法可同時定量CTAB和OBA，上機分析前僅需溶解和稀釋樣品即可，無需復(fù)雜前處理。同時，該方法耗時短，9 min內(nèi)可完成CTAB和OBA的同時測定，并具有良好的精密性及準(zhǔn)確度，可用于多種多糖疫苗及多糖結(jié)合疫苗的粗糖和精糖中CTAB和OBA殘留量的測定。