邵天舒，丁銳，周長明，郭雷

北京市藥品檢驗所國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京102206

人凝血因子Ⅷ制品是由健康人血漿經(jīng)分離、提取、純化、凍干等工藝制得的一種血液制品，是甲型血友病患者目前最有效的預防及治療出血的方法即凝血因子替代療法不可或缺的主要產(chǎn)品，患者通常需終生用藥［1-2］。鑒于該產(chǎn)品是以人血漿為原料，存在傳播人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等病毒的重大風險，原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2002年發(fā)布的《血液制品去除／滅活病毒技術方法及驗證指導原則》提出“凝血因子類制品生產(chǎn)過程中應有特定的去除／滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法”的要求［3］。目前，各生產(chǎn)企業(yè)對人凝血因子Ⅷ制品中脂包膜病毒普遍采用有機溶劑／表面活性劑（S／D）法進行滅活，其中聚山梨酯80為該方法中常用的表面活性劑之一［4］。由于聚山梨酯80具有很強的破裂細胞膜的作用，特別是注射劑中的聚山梨酯80能直接進入血液，可引起溶血、血管擴張及血壓下降等不良反應；此外，其在人體內(nèi)水解后釋放出的油酸還有誘發(fā)組胺釋放，發(fā)生急性超敏反應的風險［5］。因此，為最大限度降低血友病患者的用藥風險，《中國藥典》三部（2015版）規(guī)定，人凝血因子Ⅷ制品中聚山梨酯80殘留量應≤100 μg／mL，測定方法（簡稱藥典方法）是利用其化學結構中的聚乙氧基可與硫氰酸鈷銨反應形成藍色復合物，將該復合物溶于二氯甲烷，通過測定其在波長620 nm處的吸光度測定含量［6］。該方法為經(jīng)典方法已使用多年，但需先將樣品蛋白沉淀后離心取上清液，再通過空氣吹掃濃縮后進行顯色反應，且顯色反應過程需在室溫放置1.5 h，并每15 min振蕩1次，加之二氯甲烷極易揮發(fā)，不僅操作步驟繁瑣不便，難以滿足生產(chǎn)企業(yè)及藥檢機構大批量快速測定的需求，且試驗過程大量使用有機溶劑二氯甲烷，易造成環(huán)境污染，危害操作者健康。因此，有必要建立一種更準確、便捷、環(huán)保的方法來檢測人凝血因子Ⅷ制品中的聚山梨酯80殘留量。

聚山梨酯80是由山梨醇及其失水、雙失水化合物（山梨醇酐）與油酸和環(huán)氧乙烷縮合制得的一類強親水性化合物。由于其化學結構中含有較多的親水性基團，在常規(guī)C18色譜柱上幾乎無保留，難以測定，且其屬于大分子聚合物，在有關文獻報道中，采用高效液相色譜（HPLC）法測定聚山梨酯80含量的大多選擇分子排阻色譜［7-8］。由于人凝血因子Ⅷ制品中含有大量蛋白類物質(zhì)，在分子排阻過程中難以與聚山梨酯80峰分離。因此，本實驗選用一種將離子交換與反相分配相結合的色譜柱，該色譜柱由兩種混合模式的填料組成，即在聚N-乙烯基吡咯烷酮的表面鍵合N’，N’-二甲基丁胺，前者作為反相分離基質(zhì)，后者則作為離子交換分離基質(zhì)，使該色譜柱同時具備反相和離子交換雙重分離機理，可共同對聚山梨酯80產(chǎn)生保留作用，適用于人凝血因子Ⅷ等含蛋白質(zhì)量較高的生物制品中聚山梨酯80的分離。同時，由于聚山梨酯80無生色基團，僅有末端紫外吸收，因此一般采用蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）進行檢測［9］，但該檢測器普遍存在重現(xiàn)性差、靈敏度低等問題。而近年來出現(xiàn)的電噴霧檢測器（charged aerosol detection，CAD）是利用電暈裝置（高壓鉑金電極）使氮氣形成帶電粒子，與揮發(fā)掉溶劑的溶質(zhì)顆粒在碰撞室充分碰撞混合，使后者帶上正電，再經(jīng)高靈敏度的靜電計測量出總電信號，檢測信號與溶質(zhì)質(zhì)量呈正相關。該檢測器靈敏度高、重現(xiàn)性好，且為通用型檢測器，逐漸成為檢測無紫外吸收物質(zhì)的優(yōu)選方法［10-11］。

本研究建立了以反相-離子交換混合模式色譜柱分離、CAD檢測人凝血因子Ⅷ制品中聚山梨酯80含量的方法，并進行驗證，同時與ELSD方法進行比較，旨在為人凝血因子Ⅷ制品質(zhì)量標準的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及標準品10批人凝血因子Ⅷ樣品（批號分別為：201908054、201909056～201909060、2019-09062、201909063、201910066、201910068，規(guī)格：200 IU／瓶）由國內(nèi)A企業(yè)生產(chǎn)，為北京市藥品檢驗所批簽發(fā)留樣；聚山梨酯80標準品（批號：R072G0）為美國藥典USP標準品。

1.2 主要試劑及儀器 異丙醇（色譜級）購自德國Merck公司；無水甲酸（優(yōu)級醇）購自國藥集團化學試劑有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀（配備Corona Ultra型CAD）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；島津20AT高效液相色譜儀購自日本島津公司；Alltech 2000ES型ELSD購自美國Alltech公司；反相-離子交換混合色譜柱Oasis MAX（2.1 mm×20 mm，30 μm）購自美國Waters公司；Milli-Q型超純水機購自美國Millipore公司；WD-A藥物穩(wěn)定性檢查儀購自天津藥典標準儀器廠。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標準品溶液 精密稱取聚山梨酯80標準品1.025g，用超純水定容至100 mL，配制為10.25 mg／mL的聚山梨酯80標準品溶液，作為標準品貯備液。分別精密量取標準品貯備液0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、

2.5 mL，加超純水定容至100 mL量瓶，搖勻，配制為12.8、25.6、51.3、102.5、205.0、256.3 μg／mL聚山梨酯80的系列標準品溶液。

1.3.2 供試品溶液 取201908054、201909056～201909060、201909062、201909063、201910066、2019-10068批樣品各1瓶，分別精密加入超純水10 mL，溶解搖勻，作為供試品溶液備用。

1.4 色譜條件設置 采用色譜柱Oasis MAX；流動相A液為含2%（V／V）甲酸的異丙醇∶水（20∶80）溶液，B液為含2%（V／V）甲酸的異丙醇溶液。CAD條件：流動相流速為1.0 mL／min，柱溫為30℃，進樣量為30 μL，CAD霧化氣壓力為253.4 Pa，氮氣流速為4 L／min，霧化室溫度為30℃，采樣頻率為2 Hz。ELSD條件：流動相流速、柱溫、進樣量條件同CAD條件，ELSD漂移管溫度為105℃，空氣流速為1.6 L／min，分流模式為開。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.5 方法的驗證

1.5.1 系統(tǒng)適用性 取濃度為102.5 μg／mL的標準品溶液、供試品溶液、加標樣品溶液（1瓶樣品中加入25.6 μg／mL標準品溶液溶解）及空白溶液（超純水），分別按1.4項色譜條件檢測，采集色譜圖。

1.5.2 線性范圍 取系列標準品溶液，分別按1.4項色譜條件檢測，以聚山梨酯80濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，計算相關系數(shù)（r）。

1.5.3 定量限及檢測限 精密量取12.8 μg／mL的標準品溶液適量，進行系列稀釋后分別按1.4項色譜條件檢測，以色譜峰信噪比（S／N）≥3確定檢測限，S／N≥10確定定量限。

1.5.4 重復性 取201910066批供試品溶液6份，按1.4項色譜條件檢測，計算聚山梨酯80殘留量的RSD。

1.5.5 穩(wěn)定性 取201910066批供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、6、8、10 h，按1.4項色譜條件檢測，計算聚山梨酯80殘留量的RSD。

1.5.6 準確性 分別精密量取標準品貯備液1.6、2.0、2.4 mL，置50 mL量瓶中，加超純水定容，搖勻。取201909059批樣品9瓶，分別加入定容后的標準品貯備液10 mL，配制低、中、高濃度（32.8、41.0、49.2 μg／mL）的加標樣品各3份，按1.4項色譜條件檢測，按下式計算加標樣品中聚山梨酯80的加標回收率及RSD。

加標回收率（%）＝（實測濃度-理論濃度）／加標濃度×100%

1.6 方法的應用 分別采用藥典方法及1.4項色譜條件檢測201908054、201909056～201909060、2019 09062、201909063、201910066及201910068批樣品，按標準曲線法計算樣品中聚山梨酯80殘留量，共檢測2次。

2 結果

2.1 方法的驗證

2.1.1 系統(tǒng)適用性 聚山梨酯80標準品、供試品及加標樣品中聚山梨酯80色譜峰的保留時間均為5.9 min，供試品及加標樣品在11 min可見其他色譜峰，但與聚山梨酯80色譜峰充分分離（分離度為9.0），無干擾；空白溶液未見色譜峰。見圖1～4。表明系統(tǒng)適用性良好。

2.1.2 線性范圍 采用CAD檢測，聚山梨酯80標準品在12.8~256.3 μg／mL范圍內(nèi)，回歸方程y＝121.42x＋1.321 7，r＝0.998 0，線性關系良好。采用ELSD檢測，因其中聚山梨酯80色譜峰面積與濃度不呈線性關系，以峰面積對數(shù)為縱坐標，濃度對數(shù)為橫坐標進行線性回歸，聚山梨酯80濃度在12.8~256.3 μg／mL范圍內(nèi)，回歸方程y＝1.316 1x＋3.088 5，r＝0.998 8，線性關系良好。見圖2。

圖2 CAD（A）及ELSD檢測（B）聚山梨酯80標準品的標準曲線Fig.2 Standard curve for determination of polysorbate content by CAD（A）and ELSD（B）

2.1.3 定量限及檢測限 采用CAD檢測，定量限約為3.20 μg／mL，檢測限約為1.07 μg／mL。采用ELSD檢測，定量限約為6.41 μg／mL，檢測限約為2.14 μg／mL。表明采用CAD法優(yōu)于ELSD法。

2.1.4 重復性 采用CAD檢測，6份供試品溶液中聚山梨酯80濃度分別為55.05、54.67、53.85、53.95、53.99和53.82 μg／mL，RSD為0.86%，表明方法重復性良好。采用ELSD檢測，6份供試品溶液中聚山梨酯80濃度分別為38.69、38.05、37.59、38.00、31.58和30.98 μg／mL，RSD為9.01%，表明該方法重復性較CAD法欠佳。

2.1.5 穩(wěn)定性 采用CAD檢測，室溫放置0、2、4、6、8、10 h時，供試品溶液中聚山梨酯80濃度分別為54.08、54.92、54.13、53.88、54.44和53.97 μg／mL，RSD為0.65%，表明方法穩(wěn)定性良好。因ELSD檢測檢測重復性欠佳，未對其穩(wěn)定性進行考察。

2.1.6 準確性 采用CAD檢測，低、中、高濃度的加標樣品回收率在96.85%~101.49%之間，RSD為1.54%，見表2，表明該方法準確性良好。采用ELSD檢測，低、中、高濃度的加標樣品回收率在57.55%~63.75%之間，RSD為3.03%，見表3，表明該方法準確性較CAD法欠佳。

表2 CAD檢測的加標回收率Tab.2 Determination of spike recovery by CAD

表3 ELSD檢測的加標回收率Tab.3 Determination of spike recovery by ELSD

2.2 方法的應用10批樣品中聚山梨酯80殘留量經(jīng)CAD檢測，為56.09～66.75 μg／mL，RSD為4.9%；經(jīng)ELSD檢測，為40.16～50.40 μg／mL，RSD為6.9%；經(jīng)藥典方法檢測，為51～68 μg／mL，RSD為8.6%。見表4。結果均符合《中國藥典》要求。

表4 10批樣品中聚山梨酯80殘留量的藥典方法、CAD及ELSD法檢測結果（μg／mL）Tab.4 Determination results of polysorbate contents in ten batches of samples by the method in Chinese Pharmacopeia，CAD and ELSD（μg／mL）

圖1空白溶液（A）、聚山梨酯80標準品（B）、人凝血因子Ⅷ供試品（C）、加標樣品（D）的色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank solution（A），polysorbate 80 standard（B），human coagulation factorⅧsample（C）and spike sample（D）

3 討論

從本文方法的驗證結果比較可看出，CAD與ELSD檢測僅在線性范圍上無差異，在定量限、檢測限、重復性及準確性方面CAD均明顯優(yōu)于ELSD檢測，其原因主要有兩點：一是ELSD檢測在梯度洗脫的兩相轉(zhuǎn)換過程中的基線漂移較明顯，且達到平衡時間較長，而CAD檢測則相對平穩(wěn)，且達到平衡較快；二是由于目前CAD檢測本身具有流路切換功能，采用該功能可使死時間內(nèi)被沖出的蛋白質(zhì)直接進入廢液而避免對檢測器造成污染，而常規(guī)ELSD檢測因不具備該功能，使得較高濃度的蛋白質(zhì)進入檢測器，在0~1 min被洗脫，出現(xiàn)1個極大的蛋白峰，對后續(xù)基線平衡造成影響，同時由于大量蛋白質(zhì)在漂移管中，致使在連續(xù)進樣多針后其基線噪音升高，峰面積下降，造成重復性、準確性均較差。

10批樣品按藥典方法檢測聚山梨酯80殘留量的RSD為8.6%，高于CAD檢測的RSD（4.9%），主要原因是藥典方法操作步驟復雜，特別是在乙醇-氯化鈉飽和溶液洗滌及空氣吹掃濃縮的步驟，不同樣品之間的操作極易產(chǎn)生差異，加之溶劑二氯甲烷易揮發(fā)，上述問題均有可能導致結果出現(xiàn)較大偏差。

本實驗測定的10批人凝血因子Ⅷ制品均為同一企業(yè)2019年下半年生產(chǎn)，10批樣品中聚山梨酯80殘留量最高值與最低值的差為10.66 μg／mL，RSD為4.9%。采用S／D滅活的聚山梨酯80通常于病毒滅活工藝完成后，在后續(xù)的超濾層析等步驟中除去。盡管10批產(chǎn)品的聚山梨酯80殘留量均未超出《中國藥典》三部（2015版）規(guī)定的限值，但鑒于聚山梨酯80有引起不良反應的風險，仍建議生產(chǎn)企業(yè)通過不斷改進工藝等措施對產(chǎn)品中聚山梨酯80殘留量進行更為有效的控制。

綜述所述，本研究成功建立了檢測人凝血因子Ⅷ制品中聚山梨酯80殘留量的HPLC-CAD法，該方法在重復性、準確性及靈敏度方面均優(yōu)于ELSD，為人凝血因子Ⅷ制品質(zhì)量標準的提升提供了參考。