洪小利,嚴媛,林玲淼,朱軍莉*,黃建鋒

1(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,浙江省食品安全重點實驗室,浙江 杭州,310018) 2(浙江省方圓檢測集團股份有限公司,浙江 杭州,310018)

沙門氏菌、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等致病菌是引起食源性疾病的重要病原菌,其中腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)屬于革蘭氏陰性腸道桿菌[1]。日、美等發(fā)達國家發(fā)生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙門氏菌引起的,其中主要病原菌為腸炎沙門氏菌[2]。單增李斯特菌為革蘭氏陽性短桿菌,是一種人畜共患病的病原菌[3],感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。該菌適應(yīng)環(huán)境的能力極強,在4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一[4]。

肉桂精油是從干燥肉桂皮中提取所得的揮發(fā)油,是一種常見的香料,酚類、醛類和酮類是肉桂精油的主要活性成分,其中順反式肉桂醛的含量最高[5]。其作為香料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品以及日用品行業(yè)[6]。肉桂精油作為天然抑菌防腐劑在金黃色葡萄球菌、假單胞菌和大腸桿菌中有良好的抑菌活性[7-8]。

肉桂精油對多種食源性致病菌表現(xiàn)良好的抑菌活性[7-9],然而對食品介質(zhì)中致病菌的繁殖影響報道較少。鑒于此,本研究以腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌為研究對象,分析肉桂精油對二者的體外抑菌特點及群體感應(yīng)活性干擾,評價其對牛肉汁中2種致病菌耐受性和品質(zhì)的影響,以期為開發(fā)新型安全高效的植物源性抑菌劑以及擴大植物精油的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸炎沙門氏菌ATCC 13076、單增李斯特菌ATCC 19115,中國菌種保藏中心；肉桂精油,吉安市國光香料廠；D4540-100ML二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),美國Sigma公司；市售牛肉,杭州高沙農(nóng)貿(mào)市場；胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB)、平板計數(shù)瓊脂(plate count agar,PCA)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate,XLD)、PALCAM瓊脂,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VICTOR X酶標儀,美國Perkin Elmer公司；UV-1800紫外分光光度計,日本SHIMADZU公司；FE38-Standard臺式電導(dǎo)率儀,上海右一儀器有限公司；SIGMA3-30K冷凍高速離心機,美國Sigma公司；ME204E電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；JS-680D全自動凝膠成像分析儀,上海培清科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

將肉桂精油溶于DMSO,配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液,采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)[10]。將過夜活化的腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌菌液以5 lgCFU/mL接種量分別接種于含有0.025～1.60 mg/mL肉桂精油的TSB培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng),每4 h取樣計數(shù)細菌濃度和平板涂布計數(shù)[11]。

1.3.2 時間-殺滅曲線

參考FERRO等[12]的方法并稍作修改。以5 lgCFU/mL接種量分別接種于20 mL終濃度為MIC、2 MIC、4 MIC、6 MIC、8 MIC或MBC肉桂精油的TSB培養(yǎng)基,不添加精油為對照組。培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24 h取1 mL菌懸液,合適稀釋后,涂布計數(shù)。

1.3.3 細菌上清液的電導(dǎo)率

參考艾啟俊等[13]的方法,并適當修改。取過夜培養(yǎng)的菌液于TSB培養(yǎng)基中,使細菌濃度約為8 lg CFU/mL。加入一定量肉桂精油,使終濃度為MIC、2 MIC、MBC,對照組不添加肉桂精油,將細菌分別培養(yǎng)0、3、6、9 h后,4 000 r/min離心5 min,測定上清液電導(dǎo)率。

1.3.4 細胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)泄漏

參考HUANG等[14]的方法略修改。取過夜培養(yǎng)的菌液在8 000 r/min離心10 min,收集菌體,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)重懸并離心,重復(fù)上述操作2次,最終將菌體重懸于PBS中。取重懸菌液分別加入肉桂精油使得終濃度為MIC、2 MIC、MBC,以不添加為對照組,培養(yǎng)一定時間后取樣離心,于260和280 nm下測定上清液OD值。

1.3.5 結(jié)晶紫染色觀察細菌生物被膜

參考顧春濤等[15]的方法,并適當修改。取過夜活化的菌液接種至TSB肉湯,使2種致病菌濃度約為4 lgCFU/mL,取2 mL含菌TSB肉湯加入至24孔板中,每孔加1片滅菌的玻璃片。同時添加肉桂精油使得終濃度為1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC,混合,以不添加為對照組,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取出玻璃片,用滅菌PBS洗脫3遍后,玻片上黏附的被膜菌用0.1%結(jié)晶紫染色1 min后,水洗干燥,在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6 呋喃硼酸二酯類(autoinducer-2,AI-2)活性

參考葉曉峰等[16]的方法,并稍作修改。取過夜培養(yǎng)的菌液接種于TSB肉湯,添加肉桂精油使得終濃度為1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC,以添加等量DMSO為對照組,于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h后,離心取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾得到無菌上清液。將過夜活化的V.harveyiBB170用AB培養(yǎng)基以1∶5 000稀釋,分別將10 μL待測的無菌上清液和90 μL稀釋的BB170菌液添加至96孔酶標板。以添加等量AB培養(yǎng)基為空白對照。熒光酶標儀選擇OPS模式檢測,在30 ℃下培養(yǎng),每隔0.5 h 檢測1次,連續(xù)測定6 h。

1.3.7 牛肉汁中菌落數(shù)和感官評分

無菌取市售新鮮牛肉20 g,加入100 mL PBS緩沖液,無菌拍打均勻,制備成1∶5的牛肉汁。無菌接種2種致病菌使其濃度至104～105CFU/mL,并添加肉桂精油使最終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL,以未添加為對照組。將接種樣品置10 ℃冷藏0、24、72 h后,取樣,采用PCA、XLD和PALCAM瓊脂涂布計數(shù)。牛肉汁的感官評分由10名經(jīng)過培訓(xùn)的評價員評估氣味、色澤等感官變化[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組樣品均設(shè)3個重復(fù)組,采用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)分析處理并作圖,應(yīng)用SPSS 2.0的ANOVA進行方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油對2種致病菌生長的影響

如圖1所示,腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌在37 ℃培養(yǎng)24 h的細菌濃度分別為8.82和9.01 lg CFU/mL。肉桂精油添加能顯著抑制2種菌的生長,隨著肉桂精油濃度增加,抑菌活性增強,其中腸炎沙門氏菌在0.1 mg/mL肉桂精油處理下生長受到抑制(P<0.05),而單增李斯特菌在0.2 mg/mL肉桂精油處理下細菌基本無生長(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌在6 MIC肉桂精油處理后菌體低于2 lgCFU/mL(P<0.05),而在0.8和1.6 mg/mL濃度作用下兩者均無可見菌落生長?？梢?肉桂精油對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的MIC分別為0.1和0.2 mg/mL,MBC分別為0.8和1.6 mg/mL。

圖1 肉桂精油對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的MIC和殺菌曲線Fig.1 MIC and time-kill curves of cinnamon EO against S.enteritidis and L.monocytogenes 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2種致病菌在MIC條件下,生長受到抑制,保持初始濃度5～6 lgCFU/mL,而在肉桂精油濃度高于MIC作用下細菌濃度均低于對照組,其中腸炎沙門氏菌在2 MIC和4 MIC處理24 h后細菌濃度有所上升,可能是隨著時間的延長,肉桂精油的實際工作濃度略微降低,但明顯低于對照組(P<0.05)。當肉桂精油濃度達到MBC時,腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌分別在8和12 h后幾乎無生長?？梢?肉桂精油對腸炎沙門氏菌抑菌和殺菌活性更強。腸炎沙門氏菌的MIC和MBC值都低于單增李斯特菌,除了革蘭氏陰性細菌的細胞壁較薄,更重要的原因可能是因為兩者細胞壁組成不同,革蘭氏陰性菌細胞壁中的脂多糖存在使得精油更容易進入菌體內(nèi)。相似地發(fā)現(xiàn),肉桂精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和釀酒酵母的MIC值為0.1～0.4 μL/mL[8]。WEERAKKODY等[18]報道香料和香草精油影響細胞膜結(jié)構(gòu),肉桂、百里香、牛至等精油的主要抗菌成分能穿過細胞壁和破壞細胞質(zhì)膜。時間-殺菌曲線也發(fā)現(xiàn)MBC下腸炎沙門氏菌較短時間幾乎全部死亡,致死速率快于單增李斯特菌,與WU等[19]的結(jié)果類似。

2.2 肉桂精油對2種致病菌上清液電導(dǎo)率的影響

細菌上清液電導(dǎo)率的改變可以反映細胞膜滲透性的變化。由圖2可知,肉桂精油處理使腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌上清液中電導(dǎo)率呈現(xiàn)明顯上升(P<0.05),其中經(jīng)MIC、2 MIC和MBC肉桂精油作用9 h后腸炎沙門氏菌上清液中的電導(dǎo)率分別增加7.1%、11.3%和13.5% (P<0.05),單增李斯特菌上清液電導(dǎo)率分別增長6.4%、10.2%和12.8% (P<0.05)。結(jié)果表明,2種致病菌上清液的電導(dǎo)率呈現(xiàn)相似的增加趨勢,可能是肉桂精油處理導(dǎo)致腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的細胞膜結(jié)構(gòu)破壞,引起菌體細胞膜透性的改變,導(dǎo)致胞內(nèi)K+、Ca2+、Na+等離子從細菌細胞中大量滲出。過多的電解質(zhì)流失會導(dǎo)致細菌的死亡,與王慧敏等[20]的報道相似。

a-沙門氏菌;b-單增李斯特菌圖2 肉桂精油對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌 上清液電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of cinnamon EO on the conductivity of S.enteritidis and L.monocytogenes supernatant

2.3 肉桂精油對2種致病菌胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏的影響

細菌細胞膜能夠抵擋外界抑菌物質(zhì),可通過細胞內(nèi)蛋白質(zhì)類物質(zhì)、遺傳物質(zhì)等的泄漏來判斷細胞膜的破損。如圖3所示,相對于對照組,MIC、2 MIC、MBC組肉桂精油處理后,2種致病菌上清液中OD260值顯著上升,其中處理9 h后腸炎沙門氏菌上清液分別增加至0.16、0.22、0.44 (P<0.05),而單增李斯特菌增加至0.12、0.17、0.30(P<0.05)。肉桂精油處理后,2種致病菌上清液中OD280與OD260值呈現(xiàn)相似的上升趨勢,3種濃度肉桂精油處理 9 h后腸炎沙門氏菌上清液OD280值分別增加至0.19、0.28、0.54(P<0.05),單增李斯特菌增加至0.17、0.19、0.41 (P<0.05)。結(jié)果表明,2種致病菌隨著肉桂精油處理濃度增加,核酸和蛋白質(zhì)泄漏量逐步增加,其中腸炎沙門氏菌泄漏量更高。提示肉桂精油破壞菌體細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致核酸和蛋白的泄漏[21]。

a-核酸;b-蛋白質(zhì)圖3 肉桂精油對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌細胞內(nèi) 核酸及蛋白質(zhì)泄漏的影響Fig.3 Effects of cinnamon EO on nucleic acids and protein leakage in S.enteritidis and L.monocytogenes

2.4 亞抑菌濃度肉桂精油對2種菌生物被膜的影響

亞抑菌濃度肉桂精油對2種菌的黏附性和生物被膜的影響如圖4所示。2種致病菌培養(yǎng)24 h后都能致密地黏附到玻璃片上,特別是單增李斯特菌。2致病菌在1/4 MIC和1/8 MIC肉桂精油作用下黏附量顯著降低,1/4 MIC肉桂精油處理下2種菌在玻璃片上稀疏,零散地分布,而1/2 MIC處理下玻片上僅見少量的細菌。可見,亞抑菌濃度肉桂精油顯著降低兩菌在玻璃片上黏附性和生物被膜形成,可能與其活性成分肉桂醛具有減少食品細菌的生物被膜形成有關(guān)[15]。生物被膜形成會增強致病菌對環(huán)境消毒劑的抵抗能力[22]。

圖4 肉桂精油抑制腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的黏附Fig.4 Inhibition of cinnamon EO on adhesion of S.enteritidis and L.monocytogenes

2.5 亞抑菌濃度肉桂精油對2種菌AI-2分泌的影響

AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)是一種廣泛傳播的種間系統(tǒng),它可以調(diào)節(jié)生物發(fā)光、生物被膜形成。如圖5所示,腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌上清液熒光強度分別達到76 705和39 194 RLUs,添加1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC濃度的肉桂精油對沙門氏菌AI-2活性的抑制率分別為11.2%、24.6%、42.8% (P<0.05),而對單增李斯特菌AI-2活性抑制率分別為6.8%、20.2%、37.6% (P<0.05)。結(jié)果顯示,腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌具有AI-2活性,且前者活性更高。亞抑菌濃度肉桂精油顯著干擾2種菌AI-2的分泌,且對沙門氏菌的抑制活性更強,與抗生物被膜較一致,推測肉桂精油通過干擾群體感應(yīng)AI-2系統(tǒng)影響生物被膜的形成。相似報道顯示,香芹酚能夠抑制熒光假單胞菌和金黃色葡萄球菌AI-2活性,參與抗生物被膜形成[23]。

圖5 肉桂精油對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌 AI-2活性的影響Fig.5 Effects of cinnamon essential oil on AI-2 activity of S.enteritidis and L.monocytogenes

2.6 肉桂精油對牛肉汁中2種致病菌的抑制

進一步評價肉桂精油對冷藏牛肉汁的感官品質(zhì)和2種致病菌的影響,如圖6所示。牛肉汁對照組在10 ℃冷藏72 h后,菌落總數(shù)由初始的4.53 lgCFU/mL上升到9.27 lgCFU/mL,腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌從初始接菌量約4.50 lgCFU/mL,生長到9.12和8.99 lgCFU/mL,表明2種致病菌在營養(yǎng)豐富的牛肉汁中生長良好。與對照組相比,肉桂精油0.1、0.2、0.4和0.8 mg/mL處理冷藏牛肉汁72 h后,菌落總數(shù)分別下降1.7、3.0、4.4和7.1 lgCFU/mL,而腸炎沙門氏菌分別減少4.0、5.3、6.9、8.0 lgCFU/mL,單增李斯特菌分別下降1.9、4.1、6.1、7.3 lgCFU/mL。添加質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的肉桂精油后樣品冷藏72 h,腸炎沙門氏菌僅存活1 lgCFU/mL,而單增李斯特菌低于2 lgCFU/mL,抑菌活性弱于TSB培養(yǎng)基中。與TSB相比,牛肉汁中腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌對肉桂精油增加耐受性,單增李斯特菌尤為顯著,其中肉桂精油MIC濃度下2種致病菌仍緩慢生長繁殖,在MBC濃度下72 h仍能檢測腸炎沙門氏菌。對照組牛肉汁在10 ℃貯藏48 h后出現(xiàn)明顯異味,肉汁渾濁,局部綠色,感官評分下降到3分以下。添加肉桂精油能改善牛肉汁的感官品質(zhì),0.2 mg/mL組樣品在10 ℃貯藏72 h后稍有異味,感官評分為3.0,0.4 mg/mL組無明顯異味,顏色淡紅,感官評分為3.5,0.8 mg/mL組保持較好感官品質(zhì),評分為3.7,稍有精油氣味,感官可接受。結(jié)果表明,肉桂精油能有效抑制冷藏牛肉汁中菌落總數(shù)和2種致病菌的存活,表現(xiàn)濃度依賴性,并改善感官品質(zhì)。CALO等[24]報道食物中脂肪、蛋白質(zhì)、水分、pH和酶能潛在地減少精油活性,其中高脂肪組分需要更高濃度的精油抑制細菌生長,與食物脂肪和蛋白能夠吸收香料提取物有關(guān)[25]。

a-菌落總數(shù);b-沙門氏菌;c-單增李斯特菌;c-感官評分圖6 肉桂精油對牛肉汁中菌落總數(shù)、沙門氏菌和單增李斯特菌生長及感官評分的影響Fig.6 Effects of cinnamon EO on APC,S.enteritidis,L.monocytogenes growth and sensory score in beef juice

3 結(jié)論

研究顯示,肉桂精油對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的MIC分別為0.1和0.2 mg/mL,MBC分別為0.8和1.6 mg/mL。肉桂精油能明顯抑制2種致病菌的生長,破壞細胞膜結(jié)構(gòu),增加細胞膜的通透性,導(dǎo)致細菌死亡。肉桂精油在亞抑菌濃度下能有效干擾群體感應(yīng)AI-2活性,降低2種致病菌的黏附和生物被膜形成。肉桂精油還減少牛肉汁菌落總數(shù)和2種致病菌的增殖,改善牛肉汁冷藏的感官品質(zhì),表現(xiàn)濃度依賴性,其中對腸炎沙門氏菌抑菌活性更強。研究為植物精油應(yīng)用于冷鏈動物性食品的儲藏保鮮提供依據(jù),對保障肉類產(chǎn)品安全和延長貨架期具有重要意義。