李 笑 王 菲 彭 婕 陳 放 徐 鶯

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065）

1 引言

麻瘋樹是一種多用途能源植物，具有適應(yīng)性強(qiáng)且種子含油量高的特點，同時含有多種活性成分，如佛波酯、麻瘋樹毒蛋白、凝集素等[1]。麻瘋樹毒蛋白及一些凝集素都屬于核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）。

RIP是一類能破壞真核細(xì)胞核糖體結(jié)構(gòu)的毒蛋白，在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫時承擔(dān)調(diào)節(jié)作用[2]。根據(jù)基因的序列結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，RIP家族可分為3類[3]：I型RIP數(shù)量最多，含有單個RIP結(jié)構(gòu)域（PF00161）；II型RIP毒性較強(qiáng)，除RIP結(jié)構(gòu)域外，其C端還含有凝集素結(jié)構(gòu)域（PF00652），分別稱為A鏈和B鏈，由二硫鍵連接；III型RIP結(jié)構(gòu)與I型相比具有一個額外的20kDa的C端區(qū)域，前體多肽需經(jīng)翻譯后加工步驟去除N端、C端的短片段及中間連接序列后才具有活性，目前僅發(fā)現(xiàn)來自大麥的JIP60和來自玉米的b-32。

大戟科的沙匣樹、商陸科美洲商陸衰老和受脅迫的葉片中都提取出了核糖體失活蛋白，表明這類蛋白可能在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮功能[4]。若能從麻瘋樹中分離出高毒性的凝集素，將進(jìn)一步提高麻瘋樹的應(yīng)用價值。因此，本研究對麻瘋樹中II型RIP基因編碼的序列同源性、重要氨基酸位點進(jìn)行分析，并對其時空表達(dá)模式進(jìn)行探究，以期為高抗性、高產(chǎn)量麻瘋樹的育種提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 植物材料及處理

麻瘋樹種子購買自四川攀枝花，在種子萌發(fā)后兩周左右，待第一片真葉長約0.5～1cm，進(jìn)行組織取材，包括麻瘋樹的胚乳、子葉、第一片真葉、葉柄、莖、側(cè)根、主根等組織。在對麻瘋樹進(jìn)行干旱處理，分別在處理的第1、2、4和7天四個時間階段收集根和葉組織，同時將未處理的組織作為對照組，迅速放入液氮中，置于-80℃冰箱中保存。

2.2 生物信息學(xué)分析

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載麻瘋樹的基因組數(shù)據(jù)，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載RIP結(jié)構(gòu)域模型(PF00161)和Ricin_B_lectin結(jié)構(gòu)域模型（PF00652），利用本地HMMER程序?qū)β榀倶涞幕蚪M進(jìn)行檢索，將 E值小于1e-5的作為潛在的候選RIP序列。用ExPASy（htp://au.expasy.org）的 ComputepI /Mw計算蛋白質(zhì)的等電點、分子量。用BLAST進(jìn)行同源性對比，用MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。氨基酸序列比對在Clustal Omega中完成。蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測在SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）完成。

2.3 引物設(shè)計

利用NCBI中的primer-blast工具，根據(jù)序列設(shè)計擴(kuò)增產(chǎn)物和定量引物（表1）。

表1 所用引物序列

2.4 RNA提取及cDNA合成

根據(jù)福際生物生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒和植物總RNA提取試劑盒說明書的要求分別提取DNA和RNA，隨后立即用Takara生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說明書對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存于-20℃冰箱。

2.5 PCR擴(kuò)增與表達(dá)分析

分別以DNA和cDNA為模板，利用JcRIPII-F和JcRIPII-R擴(kuò)增基因序列。將與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物公司測序。

為保證熒光定量引物的特異性，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后驗證。以麻瘋樹Actin基因作為內(nèi)參基因，以保存的不同組織及溫度處理后的cDNA為模板，在熒光定量PCR儀進(jìn)行實時熒光分析。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme）說明書進(jìn)行RT-qPCR，相對表達(dá)量利用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。對于每種處理均使用三個技術(shù)重復(fù)和至少三個獨立的生物學(xué)重復(fù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 JcRIPII基因克隆及氨基酸序列分析

在麻瘋樹基因組中找到一個可能編碼的II型RIP蛋白的基因LOC105637075，經(jīng)可變剪切有兩種可能的蛋白編碼產(chǎn)物，分別為NP_001295735.1和XP_020536135.1（圖1A），后者比前者多出了10個氨基酸，可能是因為前者的第1位和第11位都為甲硫氨酸，是可能的起碼密碼子，因此拼接時無法判斷哪個是真正的翻譯起始位置，于是將較長的蛋白做為主要研究對象，將較短的作為其亞型。

以麻瘋樹DNA和cDNA為模板，均能擴(kuò)增出長度為1800bp左右的片段，并且測序結(jié)果片段的長度和序列一致，表明該基因的CDS區(qū)不具有內(nèi)含子。根據(jù)這一基因所在物種、編碼蛋白的名稱和類型將其命名為JcRIPII（圖1B），其對應(yīng)的理論蛋白含561個氨基酸，分子量為6.21kDa，等電點為6.18，為弱酸性蛋白。

圖1 麻瘋樹JcRIPII基因結(jié)構(gòu)及擴(kuò)增產(chǎn)物

3.2 JcRIPII基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)域分析

結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，JcRIPII基因編碼蛋白序列的N端54～247位氨基酸為A鏈RIP結(jié)構(gòu)域，C端有兩個Ricin_B_lectin結(jié)構(gòu)域（以下簡稱RBL結(jié)構(gòu)域），分別位于309～429位和441～557位。利用SWISS-MODEL構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)模型時比對到一致度和覆蓋長度最完整的模板是樟科的cinnamomin III，故將其作為模板預(yù)測JcRIPII的結(jié)構(gòu)（圖2A）。N端未預(yù)測出結(jié)構(gòu)的區(qū)域前43個氨基酸可能是信號肽區(qū)域。Cinnamomin III的A、B兩條鏈由Cys250-Cys289這兩個半胱氨酸形成的二硫鍵連接[5]，序列比對顯示在JcRIPII的相似位置處存在Cys288和Cys300，可能是它的A、B鏈間二硫鍵相連的位置，因此連接肽的位置應(yīng)位于這兩個半胱氨酸之間。

JcRIPIIA鏈的6個β-折疊和2個α-螺旋的位置與cinnamomin III相似。RIP結(jié)構(gòu)域中通常含有5個對于N-糖苷酶活性發(fā)揮至關(guān)重要的殘基位點，在JcRIPII中對應(yīng)于ricin極性親水的氨基酸Tyr80的Tyr117被替換成非極性氨基酸Gly117（圖2B），其他活性位點均保守。在ricin中Tyr80的羥基被認(rèn)為可與Gly121的羰基氧原子形成氫鍵，從而旋轉(zhuǎn)形成容納腺嘌呤的空間，因此JcRIPII這一位點的改變可能會降低JcRIPII的N-糖苷酶活性[6,7]。

JcRIPII的B鏈中由兩個同源的球狀結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域包括α、β和γ三個亞基，與ricin B鏈的結(jié)構(gòu)非常相似。首先，在JcRIPII的B鏈含有9個半胱氨酸，除Cys491外的8個半胱氨酸與ricin的分布十分相似。在ricin中，這些半胱氨酸被認(rèn)為形成4個二硫鍵，起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用[8]。同ricin一樣，JcRIPII B鏈的疏水核心的氨基酸高度保守[9]（圖2C），每個亞基中都含有QxW重復(fù)基序，只在JcRIPII中1γ亞基中表現(xiàn)為QxF[10]。不過個別氨基酸的變異值得注意，如與ricin相比1α中的Ile371被Leu354替代，1γ的Trp407被Phe429替代，2γ的Leu547被Met532替代，其中后兩處是不同性質(zhì)氨基酸的替代，這些變化可能對凝集素的活性造成影響。Ricin和cinnamomin屬于半乳糖型凝集素，這些II型RIP B鏈的六個亞基中僅有兩個亞基（1α和2γ）顯示出凝集素活性，都是依靠五個氨基酸發(fā)揮半乳糖結(jié)合作用[11]。在JcRIPII的B鏈1α和2γ的半乳糖結(jié)合位點與ricin相比存在兩處氨基酸的替換，其中2γ中Trp547取代了Tyr562，1α中His332取代了Gln349。在前一位置兩者都是芳香族氨基酸，變可能不會造成結(jié)合活性方面根本性的改變。但是，后一位置的變化引入了正電荷，其對凝集素活性的可能影響值得關(guān)注。

3.3 JcRIPII基因編碼產(chǎn)物同源性分析

利用BLAST在線工具查找與JcRIPII同源性較高的蛋白序列，結(jié)果顯示它與棕櫚科植物油棕、椰子以及山茶科的茶中的同源物具有50%以上的一致性（51.05%～54.8%）。其次是來自樟科的香樟和沉水樟的多條RIPs序列，其中有代表性的是已獲得晶體結(jié)構(gòu)的cinnamomin III。與同為大戟科的蓖麻中的II型RIP一致度最高為47.19%。選取與麻瘋樹一致度最高的序列構(gòu)建NJ樹（圖3A），系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果與序列一致度的結(jié)果相似，未表現(xiàn)出明顯的單雙子葉或同一科聚類偏好的現(xiàn)象。大戟科植物油桐、橡膠樹、蓖麻與禾本科植物疣粒稻中的II型RIP形成一個進(jìn)化樹分枝，而與JcRIPII關(guān)系較遠(yuǎn)。

為探究RIP中典型RIP結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化歷程，我們利用JcRIPII和II型RIP及兩條來自麻瘋樹I型RIP的RIP結(jié)構(gòu)域部分建構(gòu)了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3B）。結(jié)果顯示，僅從RIP結(jié)構(gòu)域序列來看，JcRIPII與同科植物II型RIP的進(jìn)化關(guān)系比與同種植物I型RIP的進(jìn)化關(guān)系更近。具體來說，麻瘋樹的JcRIPII和同科植物油桐及橡膠樹中的II型RIP的RIP結(jié)構(gòu)域序列聚類于相鄰的進(jìn)化分枝上，但是麻瘋樹中的I型和II型RIP含有的RIP結(jié)構(gòu)域序列在進(jìn)化樹上距離相對較遠(yuǎn)。值得注意的是，JcRIPII并不是與所有同科的II型RIP都緊密相鄰，它與來自蓖麻的II型RIP在進(jìn)化樹上距離就較遠(yuǎn)。同時，RIP結(jié)構(gòu)域的NJ樹中依然體現(xiàn)了JcRIPII與來自油棕、椰子和茶的RIP結(jié)構(gòu)域較近的進(jìn)化關(guān)系，它們與JcRIPII的距離僅次于兩條同科植物的II型RIP。

同時為研究II型B鏈之間的進(jìn)化關(guān)系，利用B鏈中保守的RBL結(jié)構(gòu)域區(qū)序列構(gòu)建了NJ樹（圖3C）。此時來自麻瘋樹的JcRIPII和同科植物蓖麻的II型RIP表現(xiàn)出較近的進(jìn)化關(guān)系，與油桐和橡膠樹II型RIP形成的分枝關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.4 JcRIPII上游調(diào)控元件預(yù)測分析

順式作用元件預(yù)測結(jié)果顯示JcRIPII起始密碼子上游的啟動子區(qū)中含有多種脅迫響應(yīng)和光調(diào)節(jié)有關(guān)的元件（表2）。脅迫響應(yīng)元件包括在植物創(chuàng)傷誘導(dǎo)元件，此外還含有干旱、厭氧、創(chuàng)傷誘導(dǎo)元件，表明JcRIPII可能在逆境調(diào)控中發(fā)揮作用。但是沒有發(fā)現(xiàn)與溫度脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，如HSE和LTRE等。

表2 JcRIPII上游順式作用元件預(yù)測分析

3.5 JcRIPII的表達(dá)模式初步研究

利用實時熒光定量PCR技術(shù)對JcRIPII在麻瘋樹各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析（圖4A）。發(fā)現(xiàn)除幼嫩的第一片真葉外，其他組織器官中JcRIPII基因均有表達(dá)，其中在成熟種子胚乳中表達(dá)量最高，然后依次是側(cè)根、子葉、主根、葉柄、莖，在幼嫩的真葉中未檢測到其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

圖4 JcRIPII基因表達(dá)

在干旱脅迫下，麻瘋樹葉和根中JcRIPII基因表達(dá)趨勢總體相似，即隨著脅迫的進(jìn)行JcRIPII基因表達(dá)量逐漸下降，在第2天下降到最低，隨后逐漸上調(diào)。但是JcRIPII基因在兩個組織的表達(dá)也存在一定的差異。首先，在前2天JcRIPII基因表達(dá)量下調(diào)更顯著。同時，葉中的JcRIPII基因在第7天時表達(dá)量相對于第4天上調(diào)，恢復(fù)到處理前的水平，但是根在第7天時表達(dá)量相對于第4天下調(diào)，僅為對照組中的0.4倍。

4 結(jié)語

研究表明毒麻瘋樹中存在凝集素[12]。同源比對顯示，JcRIPII的B鏈為RBL結(jié)構(gòu)域，也屬于凝集素家族，但是關(guān)于麻瘋樹中凝集素蛋白的核酸及序列信息尚未見報道。在本研究中，我們首次對麻瘋樹基因組中鑒定到的一個II型核糖體失活蛋白基因JcRIPII，基于現(xiàn)有的生物信息學(xué)工具對其可能編碼的蛋白序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并對其表達(dá)模式進(jìn)行了研究。

JcRIPII蛋白與ricin等II型RIP在三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)和N-糖苷酶活性位點存在相似性，差異主要體現(xiàn)在數(shù)個重要氨基酸位點的改變。如A鏈中對于N-糖苷酶活性至關(guān)重要的Tyr117被非極性氨基酸Gly117替換，這一替換對蛋白活性的影響是不確定的。例如將SLT-IA中的Tyr77突變?yōu)镾er后活性降低1000倍，突變?yōu)镻he后活性降低15倍，但是ricin中Tyr80突變?yōu)镻he其活性不發(fā)生改變[13,14]。B鏈中1α和2γ這兩個發(fā)揮凝集素活性的亞基中也有氨基酸的替換，在cinnamomin的2γ亞基中也存在一個相同的變化（His575替代了ricin中的Gln570），并且相關(guān)研究表明這是其活性較低ricin低的重要原因[15,16]，因此這一變化可能也會降低JcRIPII的毒性。

為探究JcRIPII基因的進(jìn)化方式，利用完整的II型RIP蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其中麻瘋樹JcRIPII并沒有與其他大戟科中的序列表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，表明JcRIPII可能存在不同于大戟科其它II型RIP如ricin的進(jìn)化起源。為探究這一現(xiàn)象是否可能是由于RIP和凝集素結(jié)構(gòu)域進(jìn)化之間的明顯差異所致，所以我們分別對這兩個結(jié)構(gòu)域區(qū)的序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。已有研究表明，大戟科中的I型RIP由原始的I型RIP進(jìn)化而來，與RBL結(jié)構(gòu)域融合形成II型RIP，部分II型RIP凝集素結(jié)構(gòu)域的缺失重新變成I型RIP[17]。在RBL結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的進(jìn)化樹，蓖麻中的II型RIP的B鏈序列位于麻瘋樹和茶等多種植物構(gòu)成的分枝外側(cè)，與JcRIPII距離較近，表明這一分枝上的II型RIP可能是源于自身I型RIP和蓖麻中凝集素基因的融合。在RIP結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的進(jìn)化樹中，JcRIPII與海桐、橡膠樹II型RIP構(gòu)成的分枝和麻瘋樹中的I型RIP相近而不相鄰，與蓖麻中II型RIP在進(jìn)化樹上關(guān)系更遠(yuǎn)，中間甚至混合了來自單子葉植物的RIP。這種鑲嵌分布反映了RIP結(jié)構(gòu)域復(fù)雜的進(jìn)化方式，RIP的起源應(yīng)該較早，至少早于單雙子葉植物分化以前。綜上，JcRIPII與樟科、山茶科、棕櫚科較近的親緣關(guān)系是因為它們B鏈中的凝集素結(jié)構(gòu)域可能都是源于蓖麻，A鏈中起源較早的RIP在進(jìn)化的過程中經(jīng)歷了多種進(jìn)化方式，造成了同科、同種植物中RIP結(jié)構(gòu)域的差異。

組織表達(dá)的結(jié)果顯示JcRIPII基因在胚乳中具有相對較高的表達(dá)量，與ricin等在種子高表達(dá)特點具有統(tǒng)一性[18]。同時JcRIPII基因在側(cè)根中具有比主根更高的表達(dá)，增加側(cè)根是植物抵御干旱的生理機(jī)制的主要器官，結(jié)合JcRIPII基因上游啟動子區(qū)中存在的干旱脅迫相關(guān)順式調(diào)控元件，表明JcRIPII基因可能也在干旱脅迫中發(fā)揮作用[19]。I型RIP基因的表達(dá)在干旱或聚乙二醇處理下往往上調(diào)，許多Ricin_B蛋白在逆境脅迫下也是誘導(dǎo)表達(dá)，而JcRIPII基因隨干旱時間的延長先下調(diào)再上調(diào)，表現(xiàn)出一定的特異性，后續(xù)還需要進(jìn)行更多的研究來闡明JcRIPII的作用方式[20,21]。