陳虹宇，祖瑩，羅慶禮，羅小娟，王丹，李德發(fā)

(1. 廣東省深圳市兒童醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518026；2. 廣東省深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會辦公室，廣東 深圳 518026；3. 安徽病原生物學(xué)省級實驗室和人獸共患病安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230032；4. 廣東省深圳市兒童醫(yī)院黨辦，廣東 深圳 518026；5. 廣東省深圳市兒童醫(yī)院院辦，廣東 深圳 518026)

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)廣泛分布于自然界，也常定植在人和動物的皮膚及與外界相通腔道中。研究表明[1]，有25%～30%的健康人群鼻前庭有SA定植。細菌在與宿主共進化的數(shù)百萬年間，不斷地修飾和調(diào)整對宿主的黏附、侵襲和致病機制，以適應(yīng)宿主的防御系統(tǒng)。青霉素應(yīng)用于臨床以前，SA感染死亡率為80%。20世紀(jì)40年代，青霉素應(yīng)用臨床不久就發(fā)現(xiàn)了耐藥的菌株，其后20年左右，80%以上的SA菌株對青霉素耐藥。隨著耐酶青霉素-甲氧西林上市，Jevons于1960年10月又分離到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)菌株。MRSA可以引起多種感染性疾病，包括皮膚軟組織感染、菌血癥、壞死性肺炎、感染性心內(nèi)膜炎和毒素休克綜合征等。MRSA的出現(xiàn)和傳播已經(jīng)成為全球關(guān)注的焦點，特別是2002年美國報道了耐萬古霉素的SA(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus，VRSA)之后。過去的幾十年里，人類與細菌之間的“斗爭”從未停止過。任何控制MRSA流行和傳播的策略，都要建立在對MRSA克隆性質(zhì)和數(shù)量的正確認識上。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)突飛猛進，對MRSA基因水平的研究更加深入細致，MRSA的流行狀況及其起源進化得到初步闡明。本研究就是利用分子生物學(xué)手段對95例住院患兒的MRSA分離株進行分子分型和序列分析，明確本地區(qū)MRSA的優(yōu)勢菌株，并根據(jù)藥物敏感性實驗分析MRSA菌株的耐藥信息，為臨床防控和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集臨床科室送檢的各類標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)細菌培養(yǎng)和鑒定分離出327株金黃色葡萄球菌，其中MRSA 95株(痰標(biāo)本64例、膿液及傷口分泌物24例、血培養(yǎng)標(biāo)本3例、關(guān)節(jié)腔穿刺液2例、腦脊液1例、尿液標(biāo)本1例)。

1.2主要試劑和儀器 分離培養(yǎng)用的血平板為鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品，VITEK 2 COMPACT 全自動細菌培養(yǎng)鑒定儀及其配套的GP鑒定卡、GP-67藥敏卡為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，鑒定質(zhì)控菌株鉛黃腸球菌ATCC 700327和藥敏質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、糞腸球菌ATCC 29212由衛(wèi)生部臨檢中心提供。細菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR預(yù)混液及DNA Marker購自生工生物工程(上海)有限公司，瓊脂糖購自西班牙GENE公司，PCR擴增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。溫度梯度基因擴增儀為德國MIONETRA公司產(chǎn)品，電泳儀和電泳槽為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)為江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1細菌DNA提取 取1 ml菌液，用細菌基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書提取樣品DNA，于-20℃保存作為所有PCR模板備用。

1.3.2mecA基因擴增 擴增引物：上游5′-AGAGTAGCACTCGAATTAGGCAGT-3′；下游5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3′；產(chǎn)物大?。?04 bp。反應(yīng)體系：細菌基因組DNA模板2.0 μl，上下游引物各1.0 μl，PCR Premix Taq 25 μl，總體積為50 μl。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，接著94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.3SCCmec分型 SCCmec分型擴增的引物和反應(yīng)條件參照文獻[2]：PCR總反應(yīng)體積為25 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，65℃ 退火45 s，72℃延伸90 s，共10個循環(huán)；再94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，共25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。見表1。

表1 SCCmec分型引物序列

1.3.4MLST分型 使用PCR檢測7個管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。引物設(shè)計(見表2)參照參考文獻[3]。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性50 s，退火溫度50℃時間30 s，72℃延伸50 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序結(jié)果在MLST數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http：//saureus.mlst.net)上比對等位基因的序列類型(sequencetype，ST)從而判定相應(yīng)菌株的ST類型。應(yīng)用eBURSTv3軟件進行菌株親緣關(guān)系分析。

表2 多位點序列分型引物序列

1.3.5spa分型 利用標(biāo)準(zhǔn)的spa基因分型方法[4]，參照文獻[5]設(shè)計一對引物，上游引物：5′-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3′；下游引物5′-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3′。PCR總反應(yīng)體系為50 μl：包括Taq PCR Master MIX 25 μl、DNA模板1 μl、10 μM引物各2 μl、ddH2O 20 μl；PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，53℃退火60 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.6藥物敏感性分析 樣本接種、分離培養(yǎng)嚴(yán)格按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》的標(biāo)準(zhǔn)流程[6]， VITEK 2 COMPACT 全自動細菌培養(yǎng)鑒定儀及其配套的GP鑒定卡、GP-67藥敏卡按說明書進行菌種鑒定及藥敏試驗，藥敏試驗結(jié)果判讀參照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[7]。

2 結(jié)果

2.1MRSA菌株的確認 細菌鑒定儀篩選出的95株MRSA菌株，經(jīng)PCR檢測mecA基因確認。95株細菌均出現(xiàn)大小為404bp的PCR擴增產(chǎn)物，說明mecA基因全部陽性。PCR擴增結(jié)果，見圖1。

注：M： DNA Marker；1～14泳道：待證實金葡菌樣品。圖1 mecA基因PCR擴增結(jié)果圖

2.2SCCmec分型結(jié)果 PCR擴增結(jié)果(見圖2)顯示，95株MRSA共有5種SCCmec基因型和3種亞型，其中SCCmecⅠ型1株，SCCmecⅡ型4株，SCCmecⅢ型17株，SCCmecⅣa型65株，SCCmecⅣb型2株，SCCmecⅣd型4株，SCCmecⅤ型2株。

注：M：DNA Marker；1～7分別是：SCCmecⅠ、SCCmecⅡ、SCCmecⅢ、SCCmecⅣa、SCCmecⅣb、SCCmecⅣd和SCCmecⅤ。

2.3MLST分型 7對管家基因擴增結(jié)果顯示，95株MRSA由10種ST型組成，其中46株為ST59型，占48.42%；另外49株MRSA分別是ST45型13株，占13.68%；ST1型和ST338型各12株，分別占12.63%；ST72型和ST398型各3株，分別占3.16%；ST88型2株，占2.11%；ST25型、ST47型和ST630型各1株，分別占1.05%；還有1株未能分型。eBURSTv3軟件分析表明，10種ST型屬于6個克隆群(CC59、CC5、CC45、CC398、CC88和CC25)，其中CC59(ST59、ST338)占61.05%(58/95)，CC5(ST1、ST72、ST630)占16.84%(16/95)，CC45(ST45、ST47)占14.74%(14/95)。

2.4spa分型 95株MRSA共鑒定出19種spa類型，另有4株待確認，其中t437型51株、t114型9株、t116型8株，分別占53.68%、9.47%和8.42%，是主要的spa型；其他型別占28.42%，t441型3株，t034、t664、t5935各2株，t4549、t1784、t1764、t189、t011、t3736、t5132、t127、t324、t3527、t078、t6378、t693和t026各1株。綜合SCCmec分型、MLST分型和spa分型三類分型結(jié)果，其中ST59-SCCmec Ⅳa-t437共有33株，約占34.74%，是最主要的流行克??；其次是ST45-SCCmec Ⅳa-t116共有7株，約占7.37%。

2.5藥物敏感試驗結(jié)果 選用14種非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物了解95株不同分子特征MRSA的耐藥情況。藥敏結(jié)果顯示，所有菌株都對環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、莫西沙星、呋喃妥因、奎奴普汀、替加環(huán)素和萬古霉素敏感，對克林霉素(82.10%)、紅霉素(82.10%)、利福平(15.78%)、四環(huán)素(41.05%)和復(fù)方磺胺甲噁唑(3.15%)等抗菌藥物分別有不同程度的耐藥，多重耐藥譜見表3。其中四種主要克隆MRSA的耐藥情況是：ST59對克林霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為89.13%、89.13%和60.87%；ST338對克林霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為91.67%、91.67%和41.67%；ST1對克林霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為75%、75%和33.33%；ST45對克林霉素、紅霉素和利福平的耐藥率分別為53.85%、53.85%和100%。

表3 不同分子特征MRSA菌株對14種非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥情況

3 討論

由于免疫力低，兒童是MRSA的主要易感人群，而且在感染類型和臨床治療等方面與成人都有較大差異。另外，不同地區(qū)不同醫(yī)療機構(gòu)由于標(biāo)本類型、收治病例以及用藥習(xí)慣不同，MRSA的檢出率和藥物敏感性也有很大差別[8-9]。因此，監(jiān)測和研究本地區(qū)兒童感染MRSA的分子流行病學(xué)特征以及藥物耐藥情況，對指導(dǎo)兒科臨床合理用藥、制定MRSA流行的防控措施、減少或延緩耐藥株的產(chǎn)生有極其重要的臨床意義。

MRSA主要是通過獲得編碼低親和力青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)的mecA基因表現(xiàn)對甲氧西林耐藥。mecA基因存在于金黃色葡萄球菌染色體盒(SCCmec)上，主要由mec基因的ccr基因復(fù)合體組成。依據(jù)mec操縱子類型和ccr型別以及J區(qū)的結(jié)構(gòu)差異性，分為Ⅰ～Ⅺ共11種類型，人源性MRSA中常見的SCCmec類型有Ⅰ～Ⅴ型5種主要基因型和Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc 3種亞型。根據(jù)來源，MRSA分為醫(yī)院獲得型MRSA(HA-MRSA)和社區(qū)獲得型(CA-MRSA)。兩者在菌株致病性、流行特征及耐藥性方面差異明顯，正確區(qū)分這兩種類型對臨床治療和疾病預(yù)后有重要指導(dǎo)意義。一般對HA-MRSA和CA-MRSA的區(qū)分主要采用美國CDC的標(biāo)準(zhǔn)[10]，然而在臨床實踐中，很多菌株會因病歷資料不全而難以依據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分。通過對MRSA進行SCCmec分型發(fā)現(xiàn)，全球范圍內(nèi)HA-MRSA菌株主要為SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，而CA-MRSA主要為SCCmec Ⅳ、Ⅴ型[11]。這種特定的SCCmec型別特征為臨床HA-MRSA和CA-MRSA的區(qū)分提供了重要的分子水平證據(jù)，相對客觀。因此，有學(xué)者[12]提議對HA-MRSA和CA-MRSA的區(qū)分采用臨床資料加SCCmec分型相結(jié)合的方法。本研究的95株MRSA中HA-MRSA和CA-MRSA分別約占23.15%和76.84% ；其中SCCmec Ⅳa型65株，占68.42%，是主要的SCCmec基因型。

多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是1998年Maiden等首次應(yīng)用于腦膜炎奈瑟菌分型的一種基于核酸序列的新型分子分型方法，與其他方法相比，具有分辨率高，數(shù)據(jù)可靠，重復(fù)性好，便于不同實驗數(shù)據(jù)比較，有利于全球范圍的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)勢。MLST通過分析選定的7個管家基因序列，將全球金葡菌分為十幾個不同的克隆集群(Clone Cluster，CC)，每個CC都有其獨特的流行區(qū)域，能較好地分析菌株間親緣關(guān)系[13]。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)兒童MRSA分離株有10種ST型，分別包含在6大克隆群(CC59、CC5、CC5、CC398、CC88和CC25)中。其中ST59、ST45、ST1和ST338共83株，占87.36%，分別屬于CC59(ST59和ST338)、CC5(ST1)和CC45(ST45)3個主要克隆群。ST59型共檢出46株，占48.42%，是優(yōu)勢序列型，也是我國CA-MRSA最見的基因型[14]。研究表明[15]，ST59較其他ST型有更強致病性，從而導(dǎo)致這一克隆在我國兒童中廣泛流行。金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus Protein A，spa)基因分型方法是基于單個基因位點的擴增測序方法，遠遠少于MLST 分型方法的7個基因位點，所以具有快速簡單、重復(fù)性好、分型結(jié)果數(shù)字化的優(yōu)點，而且成本較MLST分型低很多，便于不同實驗室間的比較，spa 分型方法目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多實驗室。本研究的95株MRSA臨床分離株有19種spa型，其中t437型51株，占53.68%，是最主要的spa基因型。與國內(nèi)學(xué)者李敏豪[16]、李文婷等[17]報道廣州、北京等地區(qū)兒童MRSA感染的臨床分離株分子類型ST59-SCCmecⅣ-t437基本一致，只是比例不盡相同。Wang Xing等[18]分析了27例血流感染社區(qū)獲得性MRSA臨床分離株，結(jié)果顯示，ST59-Ⅳ/Ⅴ-t189是最主要的克隆。

2012年，劉穎超等[19]報道了2005～2009年中國7個城市兒童MRSA感染分離株的流行克隆為ST59-MRSA-Ⅳa(t437)和ST59-MRSA-Ⅲ(t037)，可能分別屬于社區(qū)獲得性MRSA與醫(yī)院獲得性MRSA。Kang S等[20]報道，韓國兒童鼻腔定植的MRSA和臨床分離株克隆類型都是ST72-SCCmec-Ⅳ，這是在韓國流行的CA-MRSA流行株[21]。目前，全世界報道的CA-MRSA分子型別超過20種，其中ST59-IV型和ST59-V型是中國(包括臺灣地區(qū))和其他幾個亞洲國家流行的兩個主要分子型別[22]。

MRSA的耐藥情況越來越嚴(yán)重，本研究的95株MRSA臨床分離株中對β內(nèi)酰胺類抗菌藥物100%耐藥，呈現(xiàn)多重耐藥的有80株，高達84.21%；其中對β內(nèi)酰胺類抗菌藥物、林可霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類同時耐藥高達83.15%，同時對β內(nèi)酰胺類、林可霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類呈多重耐藥的為32.02%，這當(dāng)中包含了很多兒科常用抗生素，如阿莫西林、氨芐西林、羅紅霉素等；還對利福平和復(fù)方磺胺甲噁唑等抗菌藥物分別有不同程度的耐藥，且不同分子類型對抗菌藥物的耐受情況不同，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺等耐藥菌株。

目前，兒科臨床分離到的多重耐藥菌中MRSA依然是主要病原菌，給臨床治療帶來的嚴(yán)重困難，如果監(jiān)控不當(dāng)，可能會引起院內(nèi)感染或社區(qū)暴發(fā)。無論抗生素的使用是否合理，都會對細菌產(chǎn)生生存壓力，但掌握本地區(qū)臨床分離株的耐藥情況，合理使用抗生素，對耐藥菌株比例的減少和出現(xiàn)時間的延長大有幫助。因此，加強對不同地區(qū)MRSA分子特征的監(jiān)測以及分析臨床分離株的抗菌藥物耐受情況對指導(dǎo)臨床用藥十分必要。