藺佳

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種臨床上常見的老年神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病特征主要是黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元變性和過度死亡，以及因此引起的紋狀體多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少。肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫及姿勢(shì)步態(tài)障礙等為其主要臨床表現(xiàn)，帕金森病的治療目前主要是對(duì)癥治療，治療效果也因病情的不同而有明顯不同[1-3]?；颊咴诨疾『?，生活質(zhì)量會(huì)隨著病情的加重而出現(xiàn)不同程度的下降，在疾病后期會(huì)發(fā)生多種并發(fā)癥，甚至致殘，從而導(dǎo)致預(yù)后不良[4]。目前認(rèn)為，該病的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)元內(nèi)α-syncline的異常聚集密切相關(guān)[5]。但其詳細(xì)的發(fā)病因素，尤其是非基因突變的病理因素仍不十分清楚。

眾所周知，真核細(xì)胞中的RNA上有超過100種化學(xué)修飾，其中m6A是在真核生物mRNA和lncRNA中含量最為豐富的一種修飾堿基[6-7]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，平均每個(gè)mRNA上約有3～5個(gè)m6A堿基。研究發(fā)現(xiàn)mRNA甲基化的形成是一個(gè)可逆過程，甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶共同作用調(diào)控了mRNA上m6A的含量變化[8]。其中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)復(fù)合物，它主要由METTL3(methyltransferase like 3)、METTL14(methyltransferase like 14)和WTAP(Wilms tumour 1 associating protein)三部分構(gòu)成[9]。RNA去甲基化酶主要有FTO(fat mass and obesity associated protein)和 ALKBH5(alkylation repair homolog 5) ，并且FTO和ALKBH5都是鐵離子和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶[10]。mRNA上的m6A堿基在胞質(zhì)會(huì)被不同的“reader”蛋白讀取，然后引發(fā)不同的效應(yīng)。在帕金森病中，相關(guān)基因mRNA的m6A修飾狀況如何，是否也存在表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面的調(diào)控？對(duì)此問題的詳細(xì)研究還較少，有許多未知需要去探索[11-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森損傷神經(jīng)元中m6A含量的變化，并檢測(cè)了調(diào)控m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)水平，探究m6A修飾在帕金森細(xì)胞模型中可能的作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 細(xì)胞總RNA所用提取試劑盒購(gòu)自天根生物；實(shí)驗(yàn)所用胎牛血清購(gòu)買自Hyclone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自GIbico公司；所使用PCR引物均購(gòu)自于上海生工，詳細(xì)序列見表1；實(shí)驗(yàn)使用FTO siRNA的相關(guān)序列為：5′-GCAGTGTATCTGAGGAGCTCCATAA-3′；所用m6A抗體(ab2085-77)購(gòu)自abcam公司。FTO抑制劑FB23-2由華盛頓大學(xué)李靜副教授惠贈(zèng)。

1.1.2細(xì)胞株 本實(shí)驗(yàn)所使用的SHSY-5Y細(xì)胞株，購(gòu)自上海生化細(xì)胞所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 實(shí)驗(yàn)中按照雙抗∶胎牛血清∶DMEM高糖培養(yǎng)基=1∶10∶90的比例來培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，之后置于20% O2、5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，隔夜換液。培養(yǎng)至2～3 d時(shí)使用胰蛋白酶對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行消化傳代(1∶4)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)空白對(duì)照組和6-OHDA處理組，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升，之后每孔按照150 μl接種于96孔板，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8]描述，對(duì)6-OHDA組以0.025 mg/ml的6-OHDA孵育24 h進(jìn)行損傷誘導(dǎo)處理，各濃度設(shè)置6個(gè)副孔，然后取樣進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于FB23-2處理過程，則將0.1 μM的FB23-2再收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。之后調(diào)整細(xì)胞密度，設(shè)置空白對(duì)照組和6-OHDA實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，6-OHDA組以0.025 mg/ml的6-OHDA孵育進(jìn)行損傷誘導(dǎo)處理，各組并設(shè)置6個(gè)副孔。之后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，直接每孔加入10 μl CCK8試劑，再置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性 將被檢測(cè)的細(xì)胞進(jìn)行損傷誘導(dǎo)處理后，按照LDH檢測(cè)試劑盒的步驟要求，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各做6個(gè)復(fù)孔，每孔各抽取50 μl上清液加至一個(gè)新的酶標(biāo)檢測(cè)板中；之后加入配好的底物緩沖液50 μl，避光孵育30 min后，每孔加入50 μl終止液，最后在490 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

1.2.4Real-time PCR法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中甲基化相關(guān)酶mRNA表達(dá) 先根據(jù)Total RNA Kit試劑盒操作說明分別抽提對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA。之后取各組總RNA各1 μg，進(jìn)行去除基因組反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而合成cDNA，之后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體操作根據(jù)試劑盒所帶說明書和儀器操作說明書[PCR反應(yīng)體系10 μl：cDNA 1 μl，primers(10 μmol/L)0.5 μl，2×Taq PCR MasterMix 5 μl，RNase Free water 3 μl]，PCR引物見表1。PCR反應(yīng)條件為DNMT1：預(yù)變性95℃ 7 min，變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸60℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40次。本實(shí)驗(yàn)中以GAPDH為內(nèi)參基因，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)對(duì)照組。每個(gè)目的基因進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，最終以Ct值做統(tǒng)計(jì)分析。見表1。

表1 PCR所用引物

1.2.5Western blot法檢測(cè)兩種細(xì)胞與凋亡相關(guān)的蛋白酶表達(dá) 首先分別將兩種細(xì)胞用含1%PMSF的RIPA(強(qiáng))蛋白裂解液進(jìn)行裂解，后用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量定量。每組按照濃度的大小加入不同體積的PBS緩沖液和蛋白上樣緩沖液調(diào)至各組蛋白濃度一致，之后10%SDS-PAGE電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部停止，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(100 V，2 h)，預(yù)染蛋白marker確定蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)位置。含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1 h，抗體METLL14(Proteintech，26158，1∶1000)、METTL3(Abcam，195352，1∶1000)、FTO(Abcam，ERP6894，1∶1000)、ALKBH5(Abcam，ERP18958，1∶1000)，GRIN1(Biorbyt，131784，1∶1000)β-actin(Sant Cruz，水槽30656，1∶5000)分別用封閉液按比例稀釋后，放置室溫?fù)u床上搖30 min，之后4℃孵育過夜。第2天TBST洗滌3次，每次10 min；二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。再用TBST洗滌3次，每次10 min。最后使用天能凝膠成像機(jī)進(jìn)行ECL曝光。ChemiScope analysis軟件分析各個(gè)目的條帶與β-actin條帶的灰度比值，從而計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6HPLC-MS法檢測(cè)m6A含量 按照實(shí)驗(yàn)要求抽提細(xì)胞總RNA，之后用mRNA富集試劑盒對(duì)mRNA進(jìn)行富集，隨后對(duì)mRNA進(jìn)行酶降解后用堿性磷酸酶除去磷酸集團(tuán)，自備單堿基檢測(cè)液，然后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7小鼠帕金森模型的建立 將AAV介導(dǎo)shFTO定位注射在B6小鼠紋狀體，并確定敲降結(jié)果。野生型小鼠和紋狀體FTO基因敲降小鼠各8只，均腹腔注射1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)，根據(jù)密度換算，即每只小鼠每日腹腔注射劑量為 0.01 ml/kg(25 mg/kg，每周2次)，連續(xù)14 d，建模成功后，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)：爬桿實(shí)驗(yàn)：將兩組小鼠分別懸掛于一根長(zhǎng)線上，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為，小鼠雙后肢勾住掛線記為3分；小鼠僅一只后肢勾住電線記為2分，小鼠雙后肢均未勾住電線記為1分。并且記錄小鼠從懸掛到掉落的時(shí)間，即為潛伏期時(shí)長(zhǎng)。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：將小鼠分別放在轉(zhuǎn)棒疲勞儀，在轉(zhuǎn)棒上進(jìn)行適應(yīng)性放置30 s后，啟動(dòng)疲勞儀，轉(zhuǎn)速為5 r/min，讓小鼠適應(yīng)性90 s后，將疲勞儀轉(zhuǎn)速調(diào)整為16 r/min，記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒上第一次跌落的時(shí)間。最后分別收集小鼠的紋狀體檢測(cè)人合氨酸受體亞基(GRIN1)表達(dá)水平，以及氧化還原應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，本研究中小鼠處置方式均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定。

2 結(jié)果

2.16-OHDA誘導(dǎo)的模擬PD神經(jīng)元損傷模型 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.025 mg/ml的6-OHDA會(huì)明顯誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷，CCK8和LDH法檢測(cè)都表明了0.025 mg/ml 6-OHDA所致的細(xì)胞毒性(圖1A和1B)。細(xì)胞形態(tài)的變化(見圖1C)，表明6-OHDA造成了顯著的細(xì)胞損傷，符合PD的細(xì)胞模型。

注：A：CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力；B：LDH檢測(cè)細(xì)胞毒性；C：細(xì)胞形態(tài)；**表示P<0.01。

2.26-OHDA對(duì)細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和m6A含量的影響 qRCR檢測(cè)6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的與m6A相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO、ALKBH5的mRNA含量的變化(見圖2A)，發(fā)現(xiàn)只有FTO在細(xì)胞內(nèi)顯著升高。同時(shí)檢測(cè)了它們的蛋白表達(dá)水平(見圖2B)，結(jié)果與mRNA表達(dá)水平一致，僅有FTO發(fā)生顯著變化。HPLC-MS法直接檢測(cè)正常細(xì)胞和PD模型細(xì)胞mRNA中m6A的含量變化，發(fā)現(xiàn)6-OHDA組雖然有一定程度的下降，但沒有顯著性差異(見圖2C)，這可能和細(xì)胞內(nèi)m6A動(dòng)態(tài)調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制有關(guān)。

注：A：mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B：蛋白的相對(duì)表達(dá)量；C：m6A相對(duì)含量；**表示P<0.01。

2.3FTO敲低或過表達(dá)不影響PD發(fā)病相關(guān)基因的表達(dá) 在確定帕金森模型細(xì)胞中FTO升高之后，那么6-OHDA處理誘導(dǎo)的FTO表達(dá)升高是否會(huì)影響PD發(fā)病相關(guān)基因的表達(dá)水平，為驗(yàn)證該假設(shè)，通過siRNA敲低FTO的表達(dá)并用慢病毒構(gòu)建了FTO高表達(dá)細(xì)胞株，觀察在6-OHDA處理24 h后，F(xiàn)TO敲低和過表達(dá)對(duì)PD疾病密切相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示無論敲低或過表達(dá)FTO，與PD疾病密切相關(guān)基因的表達(dá)與對(duì)照組相比沒有顯著性變化(見圖3A、圖3B和圖3C)。

注：A：FTO的敲低和過表達(dá)效率；B：FTO敲低后對(duì)PD模型細(xì)胞中PD相關(guān)基因表達(dá)的影響；C：FTO過表達(dá)后對(duì)PD模型細(xì)胞中PD相關(guān)基因表達(dá)的影響。

2.4FTO對(duì)多巴胺信號(hào)通路相關(guān)基因GRIN1的表達(dá)變化的影響 為了進(jìn)一步探究6-OHDA是如何通過調(diào)控FTO，誘導(dǎo)了哪些與PD疾病相關(guān)的變化，我們對(duì)一些多巴胺信號(hào)通路相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示SH-SY5Y細(xì)胞在6-OHDA處理的情況下，過表達(dá)FTO則促進(jìn)GRIN1的表達(dá)，mRNA和蛋白的檢測(cè)結(jié)果是一致的(見圖4A和圖4B)；與此相反，敲低FTO后，GRIN1表達(dá)明顯減少。同時(shí)我們使用了FTO抑制劑 結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，猜測(cè)6-OHDA處理升高了FTO的表達(dá)，而高表達(dá)的FTO又導(dǎo)致多巴胺通路相關(guān)基因GRIN1發(fā)生改變。

注：A：mRNA的變化；B：蛋白含量的變化；B、C：FTO抑制劑處理后GRIN1的mRNA表達(dá)變化；*表示P<0.05

2.5敲降FTO基因降低了帕金森模型小鼠腦中GRIN1的表達(dá) 為在動(dòng)物模型上驗(yàn)證上述結(jié)果，紋狀體FTO敲降小鼠和野生型對(duì)照被腹腔注射MPTP造成帕金森病模型，通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在懸尾實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TO敲降小鼠的得分比野生型小鼠要高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5A；但懸尾實(shí)驗(yàn)中FTO敲降小鼠的潛伏期要長(zhǎng)于野生型小鼠(P<0.05)，見圖5B。在轉(zhuǎn)盤實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TO敲降小鼠的掉落時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于野生型小鼠(P<0.05)，見圖5C。表明FTO敲降對(duì)帕金森模型小鼠有一定的意義。另外取出小鼠紋狀體，檢測(cè)GRIN1的表達(dá)，與細(xì)胞模型上的結(jié)果類似，GRIN1也有一定程度的降低(P<0.05)，見圖5D。這表明在帕金森疾病模型中 FTO的水平會(huì)直接調(diào)控GRIN1的表達(dá)。

注：A：懸尾實(shí)驗(yàn)的評(píng)分結(jié)果；B：懸尾實(shí)驗(yàn)潛伏期；C：轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的掉落時(shí)間；D：小鼠紋狀體中GRIN1的mRNA

3 討論

PD的發(fā)生過程中會(huì)伴隨著許多基因表達(dá)的變化，越來越多的研究表明表觀轉(zhuǎn)錄修飾在PD的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了非常重要的角色[13-14]。現(xiàn)有研究表明，RNA甲基化可能與神經(jīng)退行性疾病的病變有著緊密的聯(lián)系[15]。但相關(guān)的研究主要集中在m6A和神經(jīng)突觸維持之間的關(guān)系，還沒有詳細(xì)的關(guān)于PD病理過程中m6A含量變化和機(jī)制的研究[16-17]。因此本文初步探討了PD細(xì)胞模型中m6A相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)變化。本課題采用了經(jīng)典的6-OHDA法誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞，作為PD模型細(xì)胞。CCK8法和LDH檢測(cè)法結(jié)果顯示0.025 mg/ml的6-OHDA會(huì)導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損傷，這和PD患者內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元減少類似。綜上所述，我們認(rèn)為0.025 mg/ml的6-OHDA處理可以有效地模擬PD細(xì)胞損傷。首先qPCR法檢測(cè)了6-OHDA處理的SH-SY5Y細(xì)胞中m6A相關(guān)酶FTO、ALKBH5、METTL3、METTL14的mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示大部分甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶沒有明顯變化，僅FTO有明顯的表達(dá)升高。Western-blot檢測(cè)了對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)，結(jié)果與mRNA一致，僅僅FTO明顯升高。FTO作為一個(gè)去甲基化酶，在m6A形成的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中具有重要作用。腦內(nèi)FTO的過高表達(dá)可降低神經(jīng)元內(nèi)一些基因的mRNA中m6A的含量，導(dǎo)致下游基因表達(dá)的改變，最終可能引起一系列腦損傷病變[18-20]。最近研究表明，F(xiàn)TO的異常表達(dá)將影響學(xué)習(xí)記憶、晝夜節(jié)律等，并猜測(cè)可能與一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病有一定的相關(guān)性[21-22]。我們又用HPLC-MS檢測(cè)6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中m6A的含量的影響，結(jié)果顯示6-OHDA可以降低細(xì)胞中m6A的含量，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這很可能是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)m6A的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，還存在其他潛在的調(diào)控機(jī)制。

后續(xù)主要以FTO為6-OHDA的主要影響靶點(diǎn)，首先用siRNA敲低FTO，同時(shí)用制作FTO高表達(dá)細(xì)胞株；并檢驗(yàn)了敲低和過表達(dá)效果，然后檢測(cè)了6-OHDA對(duì)正常細(xì)胞、siFTO和FTO過表達(dá)細(xì)胞的影響，我們著重觀察了和PD發(fā)病相關(guān)的PINK1、parkin、SNCA和DJ1的mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)閙6A的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，其寫入和擦除受到多種酶和細(xì)胞因子的共同調(diào)控[23]。因此僅僅敲低或過表達(dá)FTO，在6-OHDA誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞中與PD疾病密切相關(guān)基因的mRNA上甲基化位點(diǎn)還是得以保存，才會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)基本不變，通過查詢相關(guān)研究的文獻(xiàn)[8]，我們又檢測(cè)了與多巴胺信號(hào)通路相關(guān)的其他一些基因，經(jīng)過篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低FTO導(dǎo)致GRIN1有較為明顯的下降，而升高FTO則促進(jìn)其表達(dá)，mRNA和蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果是一致的，而過表達(dá)FTO則會(huì)在一定程度的升高該基因的mRNA水平。以此我們推測(cè)FTO可能是通過調(diào)控多巴胺信號(hào)通路相關(guān)基因GRIN1在PD中發(fā)揮了一定的作用。GRIN1 基因能夠表達(dá)離子型谷氨酸受體NMDAR1，致使Ca2+大量?jī)?nèi)流，造成神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載，觸發(fā)一系列 Ca2+相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如氧化應(yīng)激水平升高，線粒體功能損傷加劇等。在紋狀體FTO敲低的帕金森模型小鼠腦內(nèi)，我們也發(fā)現(xiàn)了類似效果，證明FTO在小鼠體內(nèi)和體外均可對(duì)GRIN1的表達(dá)產(chǎn)生影響。但FTO是否直接減少了GRIN1 mRNA上的m6A并且GRIN1 mRNA上的m6A又是被哪種閱讀蛋白讀取，其具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，我們觀察了6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中m6A的含量差異，也觀察了相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)變化，我們發(fā)現(xiàn)了FTO在6-OHDA損傷中有一定表達(dá)升高，并且利用siRNA敲低FTO后，最終發(fā)現(xiàn)多巴胺信號(hào)通路相關(guān)基因GRIN1在FTO敲低的情況下有顯著的下調(diào)，而升高FTO則會(huì)促進(jìn)FTO的表達(dá)。因此我們推測(cè)，F(xiàn)TO可能通過調(diào)控GRIN1的表達(dá)，在PD的發(fā)病過程中發(fā)揮了一定的作用。

致謝：該項(xiàng)目被河南省自然科學(xué)基金“Sirt6經(jīng)LKB1/AMPK/PGC1a/NRF上調(diào)線粒體生物合成”(編號(hào)202300410325)支持。