翁文鳳 伍小方 張凱旋 唐宇 江燕 阮景軍 周美亮

過表達(dá)提高苦蕎毛狀根黃酮積累及其耐鹽性

翁文鳳1,2伍小方2張凱旋2唐宇3江燕1阮景軍1周美亮2

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，550025，貴州貴陽；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，100081，北京；3四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，610100，四川成都）

轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物鹽脅迫網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用，還可調(diào)節(jié)植物類黃酮的積累。在苦蕎品種川蕎1號(hào)中克隆了1個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活活性的家族基因?；蚰鼙籒aCl和脫落酸（ABA）誘導(dǎo)表達(dá)，在莖和葉中的表達(dá)高于根中。對(duì)過表達(dá)基因毛狀根的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，總黃酮含量在過表達(dá)株系中顯著高于野生株系。同時(shí)檢測(cè)其類黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，其中黃烷酮-3-羥化酶基因（）的表達(dá)量較高?？赏茰y(cè)該過表達(dá)毛狀根株系中總黃酮的積累與的表達(dá)有關(guān)。在NaCl（100mmol/L）脅迫下，各株系的總黃酮積累受到抑制，過表達(dá)株系的含量減少至0.63mg/g。并且，在這種壓力下，的表達(dá)水平仍然高于對(duì)照。植株在受到脅迫后，對(duì)照株系的過氧化氫酶（CAT）活性顯著低于過表達(dá)株系。隨著野生型植株受到脅迫的增強(qiáng)丙二醛（MDA）含量增加，但過表達(dá)株系的含量趨于穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，在過表達(dá)毛狀根中，總黃酮的積累可能是通過關(guān)鍵酶基因的上調(diào)表達(dá)來調(diào)節(jié)的。并且可提高苦蕎毛狀根耐鹽性。通過解析對(duì)苦蕎毛狀根中總黃酮積累及植株耐鹽性的影響，為蕎麥耐鹽性和解析其耐鹽機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

苦蕎；；類黃酮；鹽脅迫

苦蕎（）（2n=16）屬蓼科，為一種藥食同源作物?？嗍w在我國西南等地有較多種植，是經(jīng)濟(jì)收入之一[1]。因其較高的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值被國內(nèi)外很多學(xué)者關(guān)注?？嗍w富含各種營養(yǎng)物質(zhì)（如抗性淀粉和蛋白質(zhì)等），生物活性物質(zhì)也是苦蕎廣受關(guān)注的原因之一，比如，類黃酮和酚類具有很好的藥用療效[2]，有降低高血壓和治療動(dòng)脈硬化的功效[3]?？嗍w生長的環(huán)境比較惡劣，常常會(huì)受到干旱、冷害和鹽害等多種逆境脅迫。而苦蕎對(duì)鹽非常敏感，鹽脅迫會(huì)抑制苦蕎生長發(fā)育、減少產(chǎn)量、降低籽粒品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。有研究[4-5]表明，在適當(dāng)鹽濃度的脅迫下，植物體內(nèi)通過增加次生代謝物（酚類化合物和萜類化合物）來抵抗逆境。而對(duì)于蕎麥這種特殊的作物來說，植株體內(nèi)黃酮類次生代謝物蘆丁的大量積累又能增加其藥用價(jià)值。因此，研究苦蕎中黃酮積累和耐鹽性之間的關(guān)系尤為重要。

是最大的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控家族之一，由富含堿性氨基酸殘基的DNA結(jié)合域和亮氨酸拉鏈二聚結(jié)構(gòu)域相鄰的蛋白質(zhì)組成[6]，在植物光信號(hào)、種子成熟、花發(fā)育、種子積累蛋白、非生物和生物脅迫等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用[7]。轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于很多物種中，例如：苦蕎基因組中有96個(gè)基因[7]，擬南芥中有75個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)[8]，水稻中有89個(gè)[9]，小麥中約有187個(gè)[10]。在植物對(duì)逆境調(diào)控的機(jī)制研究中，的功能已經(jīng)在國內(nèi)外都有了一定的報(bào)道，如鹽脅迫下，植物體內(nèi)的耐鹽基因可以通過轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)來表達(dá)，從而提高植株的耐鹽性[7]。

Liu等[11]研究表明，鹽脅迫相關(guān)基因可被轉(zhuǎn)錄因子激活表達(dá)，提高植株的抗逆性，如在擬南芥中，激活了鹽脅迫響應(yīng)因子，從而提高了耐鹽性。Zhang等[12]研究表明，轉(zhuǎn)錄因子可通過脫落酸（ABA）介導(dǎo)的信號(hào)途徑參與鹽脅迫響應(yīng)，如在水稻遭受鹽脅迫后，水稻轉(zhuǎn)錄因子通過提高體內(nèi)ABA含量來增強(qiáng)其耐鹽性。植物的耐鹽性還可以通過體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來提高，有研究[13]表明，具有基因的煙草可以在鹽脅迫后增加超氧化物歧化酶（SOD）的活性并降低過氧化氫的含量，使得耐鹽性提高。有趣的是，有學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)錄因子通過與黃酮合成途徑的相關(guān)酶基因和啟動(dòng)子序列中的光調(diào)節(jié)單元（LR-Us）協(xié)同結(jié)合參與黃酮類物質(zhì)的合成。因此，克隆苦蕎轉(zhuǎn)錄因子，研究其在鹽脅迫下在苦蕎毛狀根中發(fā)揮的作用，為深入了解蕎麥的抗逆機(jī)理和培育抗逆蕎麥品種奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。

已有研究[15]表明，苦蕎中在抗鹽抗旱中發(fā)揮重要作用，并且也有報(bào)道[16]指出轉(zhuǎn)錄因子家族中的某些成員具有調(diào)節(jié)黃酮合成的作用。因此，從川蕎1號(hào)中克隆得到基因，分析檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性及FtbZIP5蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。通過qRT-PCR分析不同濃度NaCl（0、50、100、150mmol/L）誘導(dǎo)下基因的時(shí)空表達(dá)模式，通過將其整合到過表達(dá)載體pCAMBIA1307中，誘導(dǎo)過表達(dá)毛狀根，檢測(cè)總黃酮含量，研究基因?qū)嗍w類黃酮合成代謝通路的影響。通過檢測(cè)在100mmol/L NaCl處理0、1、3、5d的毛狀根過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量，評(píng)估其抗鹽能力，從而解析基因?qū)嗍w黃酮合成和鹽脅迫的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與脅迫處理

以川蕎1號(hào)種子（由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所蕎麥基因資源創(chuàng)新組提供）為材料。首先，用鑷子剝?nèi)ソ莺笞冘浀姆N皮，加入15～20mL 1% NaClO震蕩6min，15～20mL 75%乙醇搖晃3min，用無菌水洗滌5～6次，將其放入MS培養(yǎng)基中，置于組織培養(yǎng)室（光照2000lx，16h/8h）中生長10d。選擇生長狀態(tài)一致的幼苗，移入MS液體培養(yǎng)基中，用搖床120轉(zhuǎn)/min搖24h。分別加入不同濃度（0、50、100、150mmol/L）NaCl和ABA（100μmol/L），在0、1、6和12h將幼苗的根、莖、葉單獨(dú)取樣，然后立即儲(chǔ)存在-80℃冰箱用于提取RNA。

1.2 FtbZIP5基因的克隆及qRT-PCR分析

利用諾唯贊相關(guān)試劑盒按照說明書立即將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用基因特異性引物，以該cDNA為模板，克隆得到基因，其基因引物見表1。用同源重組的方法構(gòu)建一個(gè)含強(qiáng)啟動(dòng)子35S的過表達(dá)載體；以HI和RI為限制性酶切位點(diǎn)，將的編碼區(qū)（）連接到植物過表達(dá)載體pCAMBIA1307中。

基因的熒光定量PCR引物在NCBI中設(shè)計(jì)，以作為內(nèi)部參考基因，參照盧曉玲等[17]的引物序列。使用TaKaRa, SYBR Premix EXTaqTM（Perfect Real time）（R820A）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析。公式為（RQ）=2-ΔΔCT，計(jì)算相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 FtbZIP5的轉(zhuǎn)錄激活

使用同源重組法將的插入AS2-1載體的I和I多克隆位點(diǎn)中，并與pACT2空載體共轉(zhuǎn)化PJ69-4A感受態(tài)細(xì)胞。將其涂板于SD/-Leu-Trp（SD-LT)，28℃倒置培養(yǎng)2d，挑單克隆于1×TE buffer液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12～16h，點(diǎn)于含濃度5和15mmol/L 3-AT的SD/-Leu-Trp-His（SD-LTH）缺陷培養(yǎng)基上，拍照觀察。其陰性對(duì)照為pAS2-1與pACT2空載體共轉(zhuǎn)化PJ69-4A感受態(tài)細(xì)胞。其引物見表1。

1.4 FtbZIP5基因的生物信息學(xué)分析

利用在線平臺(tái)（表2）對(duì)FtbZIP5蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫挑選10個(gè)已報(bào)道基因功能的同家族基因，使用MegaX軟件（鄰域連接法）建立關(guān)于FtbZIP5蛋白的進(jìn)化樹。

1.5 過表達(dá)FtbZIP5毛狀根的誘導(dǎo)及總黃酮測(cè)定

將含目的片段的過表達(dá)載體pCAMBIA1307-通過A4發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，侵染川蕎1號(hào)幼苗的莖和葉，誘導(dǎo)毛狀根，取主根系進(jìn)行PCR鑒定，參考談天斌等[18]的方法。選取陽性根系，培養(yǎng)在MS+100mg/mL頭孢霉素的培養(yǎng)基上。然后選擇健壯的主根系轉(zhuǎn)移到MS液體（含頭孢霉素）培養(yǎng)基中，在黑暗條件下，搖床120轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)1個(gè)月，并更換1次培養(yǎng)基以保證有充足的營養(yǎng)供毛狀根吸收。在波長420nm處，利用AlCl3分光光度法[19]測(cè)定過表達(dá)毛狀根的總黃酮含量，以A4和空載體（1307空）毛狀根為對(duì)照。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為=19.946+0.5193（2=0.9954），其中，為吸光值，為蘆丁濃度。為了研究對(duì)黃酮類化合物的調(diào)節(jié)作用，檢測(cè)其黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶基因是重要的，因此，挑選了基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.6 過表達(dá)FtbZIP5毛狀根耐鹽性鑒定

將上述誘導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)移到MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，再次轉(zhuǎn)移至MS液體培養(yǎng)基（含100mmol/L NaCl）中，在相同條件下培養(yǎng)。并在培養(yǎng)第0、1、3、5天時(shí)取樣，并立即儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。主要通過過表達(dá)毛狀根的黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量和檢測(cè)活性氧代謝相關(guān)酶（CAT）活性及物質(zhì)（MDA）評(píng)價(jià)毛狀根的耐鹽性。利用酶活檢測(cè)試劑盒（索萊寶生化公司）檢測(cè)相關(guān)酶活性。

表1 引物序列匯總

表2 在線平臺(tái)匯總

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎FtbZIP5基因的鑒定

苦蕎基因全長1260bp，共含419個(gè)氨基酸。用ExPASy ProtParam進(jìn)行序列分析，F(xiàn)tbZIP5編碼蛋白的等電點(diǎn)5.06，分子量101153.96，分子式C3742H6226N1260O1555S231；共包含4種氨基酸，其含量從高到低依次為Ala（32.0%）、Gly（26.3%）、Thr（23.3%）和Cys（18.3%）。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)預(yù)測(cè)為43.63，為親水蛋白，相對(duì)不穩(wěn)定。利用Cell-ploc 2.0預(yù)測(cè)出位于細(xì)胞核中。圖1a為蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，無規(guī)則卷曲占比最高，為57.28%；其次為α螺旋，占30.31%；β折疊延伸鏈和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)分別占10.74%和1.67%。其中，在中間分布的有無規(guī)則卷曲和折疊延伸鏈，兩端主要分布α螺旋，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)主要分布在碳端。對(duì)其FtbZIP5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，該蛋白具有亮氨酸拉鏈典型結(jié)構(gòu)（圖1b）。將與其他已報(bào)道的11個(gè)轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1c）。結(jié)果表明，與小麥耐鹽轉(zhuǎn)錄因子、和距離較近。從川蕎1號(hào)中克隆得到（圖1d）。

2.2 轉(zhuǎn)錄激活活性

如圖2所示，pAS2-1-FtbZIP5+pACT2和對(duì)照pAS2-1+pACT2的原液和稀釋液都能在SD-LT缺陷培養(yǎng)基上生長；只有pAS2-1-FtbZIP5+pACT2能在含5或15mmol/L 3-AT的SD-LTH缺陷培養(yǎng)基上正常生長，對(duì)照pAS2-1+pACT2沒有生長跡象。表明FtbZIP5在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

a：FtbZIP5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；α螺旋(藍(lán)色)；折疊延伸鏈(紅色)；β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(綠色)；無規(guī)則卷曲（紫色）。b：FtbZIP5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。c：FtbZIP5蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。d：FtbZIP5基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增

1×：原液；10×：稀釋10倍

2.3 FtbZIP5基因在NaCl和ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式

2.3.1 鹽脅迫下的組織特異性分析 為了進(jìn)一步確定是否參與了鹽脅迫信號(hào)通路，在各組織中，利用qRT-PCR分析了基因受NaCl誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，并以為內(nèi)參。結(jié)果（圖3a）表明，基因?qū)}脅迫很敏感，在不同濃度NaCl處理1h后，基因在根、莖、葉中的表達(dá)水平顯著升高。且隨著濃度的升高，根中基因的相對(duì)表達(dá)量也升高，在NaCl 150mmol/L時(shí)最高，是CK（NaCl 0mmol/L）的8倍。在莖中，在NaCl 100mmol/L時(shí)，表達(dá)量升至最高，比CK高出16倍，隨后降低?；蛟谇o中的表達(dá)趨勢(shì)與葉相同。如圖3b所示，在用NaCl處理6h以后，在根中的表達(dá)受到抑制。在莖和葉中，隨著濃度的增加表達(dá)量有升高的趨勢(shì)，在NaCl 150mmol/L時(shí)，葉中的表達(dá)量高達(dá)16.50，約是莖（8.13）中的2倍。這表明植物不同組織受到鹽脅迫影響是有先后順序的，依次是根、莖、葉。

2.3.2 ABA誘導(dǎo)下的組織特異性分析 如圖3c所示，ABA（100μmol/L）處理后，在不同組織中的表達(dá)量都在1h內(nèi)迅速增加；且在莖和葉中的表達(dá)水平比CK（處理0h）高出40倍以上。在各處理時(shí)間段，在根中穩(wěn)定表達(dá)；在莖中隨著處理時(shí)間的延長，表達(dá)量降低；在葉中也是如此。因此，可能參與了苦蕎對(duì)ABA誘導(dǎo)的外源脅迫反應(yīng)和鹽脅迫反應(yīng)。

顯著差異性用“**”代表，表示P < 0.01，下同

綜上所述，基因在莖和葉中都有高表達(dá)水平，且受NaCl和ABA誘導(dǎo)時(shí)間和濃度的影響。

2.4 過表達(dá)FtbZIP5基因?qū)γ珷罡傸S酮積累的影響

通過對(duì)組成型過表達(dá)毛狀根總黃酮的檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示調(diào)控毛狀根中的黃酮類物質(zhì)積累。通過成功誘導(dǎo)出基因的過表達(dá)植株（圖4a），檢測(cè)了3個(gè)過表達(dá)毛狀根株系和對(duì)照（A4和1307空載體毛狀根）的基因表達(dá)量，結(jié)果（圖4b）顯示，3個(gè)株系中的的表達(dá)量都比CK高出幾十至百倍，說明過表達(dá)株系構(gòu)建是成功的。

①生長10d后的川蕎1號(hào)無菌苗；②外植體共培養(yǎng)；③誘導(dǎo)10d后的外植體；④陽性毛狀根

選擇3個(gè)A4、1307空載體株系和3個(gè)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在同一階段取樣，用分光光度計(jì)法測(cè)定毛狀根總黃酮含量；其標(biāo)準(zhǔn)曲線為=19.946+0.5193（2=0.9954）。結(jié)果（圖5a）顯示，基因過表達(dá)株系的總黃酮含量達(dá)到0.96mg/g，約是A4野生型株系的2倍，表明基因能夠促進(jìn)黃酮類化合物的合成。用qRT-PCR檢測(cè)關(guān)鍵酶基因（）的表達(dá)量，如圖5b所示，除了的表達(dá)量有升高的趨勢(shì)外，過表達(dá)毛狀根中的表達(dá)量都沒有顯著上調(diào)甚至是下調(diào)。表明基因可能是通過調(diào)節(jié)黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶基因來促進(jìn)黃酮類化合物的合成。

2.5 FtbZIP5的過表達(dá)毛狀根的抗鹽性鑒定

圖6a所示，用NaCl（100mmol/L）脅迫毛狀根，在7d時(shí)，過表達(dá)毛狀根總黃酮含量為0.63mg/g，顯著低于不處理時(shí)（0.96mg/g），與1307空毛狀根未處理時(shí)的含量（0.64mg/g）相差不大。

PAL：苯丙氨酸解氨酶基因；CHS：查爾酮合成酶基因；CHI：查爾酮異構(gòu)酶基因；F3H：黃烷酮3-羥化酶基因；RT1：鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因?！?”表示P < 0.05，下同

以1307空為對(duì)照，在NaCl（100mmol/L）脅迫毛狀根3d后，檢測(cè)了過表達(dá)株系中黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況。圖6b所示，關(guān)鍵酶基因在過表達(dá)株系中有升高的趨勢(shì)，是1307空的1.5倍；而和都是下降的，表明在鹽脅迫下，黃酮途徑的關(guān)鍵酶基因在黃酮合成途徑中發(fā)揮著重要作用。

如圖6c所示，隨著脅迫時(shí)間的增長，-OE的CAT活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，并在脅迫3d時(shí)最高，為32.26U/g，是對(duì)照（1307空）的2倍多；在脅迫5d時(shí)，A4毛狀根的CAT活性低至6.19U/g，但-OE的CAT活性（24.20U/g）和脅迫0d時(shí)（21.39U/g）差異不大。由此可知，在鹽脅迫下，毛狀根可能通過增加體內(nèi)的CAT活性來清除過氧化氫等活性氧，從而提高了毛狀根的耐鹽性。

MDA含量的高低代表了植株體內(nèi)膜脂受損傷的嚴(yán)重程度，也是一個(gè)評(píng)價(jià)植物耐鹽性的指標(biāo)。由圖6d可看出，其含量在NaCl脅迫后先升高后降低。A4和1307空株系毛狀根MDA含量升高至3d時(shí)達(dá)到最高值（A4為14.39nmol/g，1307空為18.50nmol/g），高于FtbZIP5-OE（10.36nmol/g）；在NaCl的不斷脅迫下，其含量在-OE中趨于穩(wěn)定，且顯著低于另2個(gè)株系（＜0.01）。由此可以看出，在相同的鹽脅迫下，過表達(dá)株系膜脂過氧化程度較低，被損害程度低。

3 討論

本研究從川蕎1號(hào)中克隆了一個(gè)抗鹽轉(zhuǎn)錄因子基因，它通過調(diào)控黃酮合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)蕎麥類黃酮物質(zhì)的合成。與其他研究[15]結(jié)果類似，該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，對(duì)基因在川蕎1號(hào)不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，鹽脅迫和外源ABA都誘導(dǎo)的表達(dá)，且在莖和葉中表達(dá)較明顯。通過建立過表達(dá)毛狀根株系，檢測(cè)到相關(guān)酶基因（黃酮合成途徑）在毛狀根中的表達(dá)，可知基因通過調(diào)控黃酮合成關(guān)鍵酶基因來調(diào)節(jié)黃酮類物質(zhì)的合成。通過對(duì)毛狀根進(jìn)行鹽脅迫處理，過表達(dá)株系的總黃酮含量顯著高于對(duì)照。且過表達(dá)毛狀根可能通過提高CAT活性和降低MDA含量來增強(qiáng)其耐鹽性。

在蕎麥中，已經(jīng)有成熟的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系，且得到的毛狀根遺傳穩(wěn)定性高。它們由同一細(xì)胞分化而來，得到的陽性過表達(dá)毛狀根的概率高，在培養(yǎng)中的增長速度快，且次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量都高于原植株含量[20]。因此，毛狀根是研究蕎麥重要生物活性物質(zhì)積累的代謝途徑的理想生物模型。在逆境脅迫下，植株體內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累對(duì)其耐鹽能力有著很重要的影響，如SOD和MDA對(duì)植物具有重要的保護(hù)作用[21]。因此，本文通過研究蕎麥毛狀根的耐鹽性，為蕎麥耐鹽生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

植物受鹽害主要表現(xiàn)為體內(nèi)的生理干旱和活性氧的過度積累。植物遭受嚴(yán)重的鹽害會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞和組織的氧化損傷，并降低植物產(chǎn)量和品質(zhì)[22]。有研究[16]表明，在苯丙素途徑中產(chǎn)生的黃酮類代謝產(chǎn)物會(huì)在鹽脅迫后發(fā)生變化。在水稻上，花青素、芹菜素-7-O-葡糖苷和毛地黃皂苷等黃酮類化合物可作為植物體內(nèi)的抗氧化劑，它們通過除去活性氧和降低氧化損傷程度來保護(hù)植物，阻止植株和離體的葉片失水，保證植株正常生長[23-24]。本研究中，過表達(dá)能促進(jìn)總黃酮的積累，推測(cè)其毛狀根株系具有一定的耐鹽性。

在植物體內(nèi)，黃酮合成受到和等酶基因的調(diào)節(jié)和光照、溫度、逆境脅迫和紫外線等環(huán)境因子的影響[14]。之前的研究[25]表明，植物在鹽脅迫下，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生茉莉酸等激素來誘導(dǎo)參與苯丙素途徑的酶（苯丙氨酸解氨酶），從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的合成。也有研究[26]發(fā)現(xiàn)，在用NaCl處理蕎麥時(shí)，蕎麥體內(nèi)黃酮合成基因的表達(dá)量顯著增加，導(dǎo)致了黃酮化合物的積累增加。擬南芥中已報(bào)道出轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)節(jié)光誘導(dǎo)的類黃酮合成途徑，主要是與黃酮合成關(guān)鍵酶基因和啟動(dòng)子結(jié)合，參與控制光誘導(dǎo)的類黃酮生物合成[14]。在本研究中，促進(jìn)過表達(dá)毛狀根株系的總黃酮積累，且F3H酶基因上調(diào)表達(dá)。并且在鹽脅迫下，黃酮合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)沒有受到抑制，表明在鹽脅迫下，很可能是通過調(diào)節(jié)黃酮合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來調(diào)控黃酮合成。

受到鹽脅迫后，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列酶清除物質(zhì)（過氧化物酶）和非酶清除物質(zhì)（黃酮類物質(zhì)）來提高植物的耐鹽性[27]；在本研究中，受到脅迫后的過表達(dá)毛狀根的總黃酮含量（0.63mg/g）高于對(duì)照植株。經(jīng)過100mmol/L NaCl處理不同時(shí)間后，過表達(dá)株系的CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這表明在適當(dāng)?shù)柠}脅迫誘導(dǎo)下，植物可能通過提高體內(nèi)的CAT活性來清除活性氧，維持植株正常生長，提高植物耐鹽性[28]。在植物中，MDA的積累升高了膜脂過氧化程度，抗逆性降低[29]；在文中的過表達(dá)毛狀根株系中，MDA含量最低，表明該株系體內(nèi)的過氧化程度低，組織細(xì)胞膜損傷程度低，受到的傷害較小，所以耐鹽性強(qiáng)。綜上所述，基因通過調(diào)節(jié)黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶基因來調(diào)控黃酮合成。在鹽脅迫下，通過過表達(dá)，增加了毛狀根CAT活性，并降低了MDA含量，從而提高了其耐鹽性。因此，基因上調(diào)提高了苦蕎毛狀根黃酮合成并提高其耐鹽性。

4 結(jié)論

在鹽脅迫下總黃酮的積累可能與關(guān)鍵酶基因的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。并且在鹽脅迫下，可以通過在毛狀根中積累次生代謝產(chǎn)物CAT并減少M(fèi)DA的積累來提高毛狀根的耐鹽性。據(jù)此推測(cè)基因上調(diào)提高了苦蕎毛狀根黃酮合成并提高其耐鹽性。

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The Overexpression ofImproves Accumulation of Flavonoid in the Hairy Roots of Tartary Buckwheat and Its Salt Tolerance

Weng Wenfeng1,2, Wu Xiaofang2, Zhang Kaixuan2, Tang Yu3, Jiang Yan1, Ruan Jingjun1, Zhou Meiliang2

(1College of Agronomy, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3College of Food Science and Technology, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, Sichuan, China)

Thetranscription factors, with an important role in salt stress network, can regulate flavonoid accumulation in plant. In this paper, thefamily genewith transcriptional activation activity, was cloned from the ‘Chuanqiao 1’. Expression ofgene in stems and leaves was higher than that in root when treated by NaCl and abscisic acid. Flavonoid detection was carried out on hairy roots of overexpressing thegene strain, and results showed that flavonoid accumulation in overexpressing strains was significantly higher than that in wild-type plants. And the expression of key enzyme gene flavanone-3-hydroxylase () in flavonoid synthesis pathway was high, which can speculate that accumulation of total flavonoids in overexpressed hair root strains was associated withexpression. Under the stress of 100mmol/L NaCl, the accumulation of total flavonoids in all lines was suppressed, and the content of total flavonoids in overexpression lines decreased to 0.63mg/g, and the expression ofwas still higher than that of the control. Catalase activity of the control was significantly lower than that of the overexpressing strains after stressing. After stressing by NaCl, the content of malondialdehyde in wild-type plants increased and that in overexpressing strains was stable. The above results indicated that overexpressing thegene in the hairy roots, the increase in total flavonoid content may be regulated by the up-regulation of the key enzyme gene; andalso improved the salt tolerance of tartary buckwheat roots. This paper analyzed the role ofin the accumulation of total flavonoids and salt tolerance in the hairy roots of tartary buckwheat, and laid a foundation of studying the salt tolerance of buckwheat and analyzing the salt tolerance mechanism of buckwheat.

Tartary buckwheat;; Flavonoids; Salt stress

10.16035/j.issn.1001-7283.2021.04.001

翁文鳳，主要從事蕎麥品質(zhì)抗逆研究，E-mail：1332721469@qq.com

阮景軍為通信作者，研究方向?yàn)榭嗍w種質(zhì)資源創(chuàng)新和抗逆境關(guān)鍵基因挖掘，E-mail：jjruan@gzu.edu.cn；周美亮為共同通信作者，研究方向?yàn)槭w麥屬植物種質(zhì)資源與品質(zhì)抗逆研究，E-mail：zhoumeiliang@caas.cn

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1001300，2019YFD1001304）

2021-01-12；

2021-05-08；

2021-05-28