張文超 方秧青 鐘靜紅 張 明

（1 余姚市人民醫(yī)院麻醉科，余姚 315400，2 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院藥劑科，寧波 315000）

缺血性心臟病是死亡的主要原因之一，盡早恢復(fù)缺血區(qū)域的血液灌注是治療缺血性心臟病患者的有效方法，然而血流的恢復(fù)可能會(huì)導(dǎo)致組織損傷，稱為心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷[1-2]。粉防己堿（tetrandrine，Tet）是一種雙芐基四氫異喹啉生物堿，已被證明對(duì)多種心血管疾病有益，例如高血壓、心律不齊、心絞痛、門脈高壓癥等[3]。粉防己堿還可以保護(hù)動(dòng)物免受缺血再灌注引起的心肌損傷，但其機(jī)制仍不清楚。Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路參與了包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡和炎癥等多個(gè)生理過(guò)程[4]。先前的研究表明，JAK2-STAT3 對(duì)于缺血后心臟保護(hù)至關(guān)重要，缺血后JAK2-STAT3 的激活增加了線粒體中磷酸化STAT3 的表達(dá)，從而改善了線粒體功能，并最終減輕了心肌I/R 損傷[5]。但是，JAK2-STAT3 信號(hào)通路是否在粉防己堿給藥后的心臟保護(hù)中起作用尚不明確，故對(duì)其進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

32 只成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠（體質(zhì)量250～300 g）由杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（生產(chǎn)許可（浙）2019-0004）提供。大鼠在22℃±2℃的自然光（12 h）和黑暗（12 h）循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)條件下，喂食普通的實(shí)驗(yàn)室食物，并在實(shí)驗(yàn)期間自由飲水。

兔抗JAK2 單克隆抗體，兔抗p-JAK2 單克隆抗體，兔抗STAT3 單克隆抗體，兔抗p-STAT3 單克隆抗體，Bax、Bcl-2、GAPDH 抗體和辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自Cell Signaling Technology；JAK2 抑制劑AG490 購(gòu)自Sigma-Aldrich；戊巴比妥購(gòu)自上海泰瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型建立及動(dòng)物分組

將32 只大鼠隨機(jī)分為4 組，每組8 只。①假手術(shù)組（Sham 組）；②缺血再灌注組（I/R 組），腹腔注入生理鹽水1.2 mL 預(yù)處理后行I/R；③粉防己堿組，在進(jìn)行I/R 前1 h 腹腔內(nèi)注射3 mg/kg（約1.2 mL）粉防己堿，余同I/R 組；④粉防己堿+ AG490組（Tet+AG490 組），在進(jìn)行I/R 前1 h 腹腔內(nèi)注射粉防己堿和AG490，余同粉防己堿組。大鼠心肌I/R 模型的建立采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法制備[6]，用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg 腹腔內(nèi)）麻醉大鼠，并使用小動(dòng)物呼吸機(jī)（HX-101E）以體積控制模式每分鐘80 次進(jìn)行人工通氣。然后，從左胸骨邊界沿第5 個(gè)肋間隙通過(guò)左胸廓切開(kāi)術(shù)暴露左腋窩，使用6-0 手術(shù)縫合線將左前降支冠狀動(dòng)脈（LAD）結(jié)扎至距其起點(diǎn)約2 mm，通過(guò)觀察縫合線下方左心室的淺心肌層確認(rèn)閉塞，心肌缺血30 min，然后再灌注4 h。假手術(shù)組中縫合線在LAD 下通過(guò)，但沒(méi)有閉塞。

1.3 血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)

使用Powerlab/8SP 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)收集再灌注結(jié)束時(shí)的心率（heart rate，HR）、左心室舒張壓（left ventricular developed pressure，LVDP）、左心室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）和左心室內(nèi)壓最大上升速率（maximum rate of rise and fall of left ventricular pressure，+dp/dtmax）。

1.4 氯化三苯基四氮唑（TTC）測(cè)量心肌梗死面積

再灌注結(jié)束時(shí)，將心立即置于-80℃的冰箱中，然后沿心矢狀切面切成2～3 mm 厚的切片，置于TTC 溶液（37℃，1%TTC，pH 7.4）中25 min，然后放入10%甲醛溶液中固定過(guò)夜。用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像后，使用Image J 軟件分析梗死區(qū)域。

1.5 乳酸脫氫酶（LDH）含量的測(cè)定

通過(guò)測(cè)量冠狀動(dòng)脈流出液中的LDH 濃度評(píng)估心損傷程度。按照制造商的說(shuō)明，使用日立全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定冠狀動(dòng)脈流出液的LDH 水平。

1.6 心肌三磷酸腺苷（ATP）含量測(cè)定

稱取心肌組織1 g，3000 r/min 離心5 min，取上清液，按照ATP ELISA 檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.7 線粒體活性氧（ROS）生成的測(cè)定

差速離心法提取線粒體，熒光標(biāo)記2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）測(cè)量線粒體ROS 生成速率。

1.8 免疫印跡檢測(cè)心肌p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白水平

用于SDS-PAGE 的含有30 μg 蛋白質(zhì)的樣品（Invitrogen 公司）裂解，密封并轉(zhuǎn)移至膜上。將其與p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Bcl-2、Bax 和GAPDH 一抗（4 ℃，1∶1 000）孵育過(guò)夜。然后用TBST 溶液清洗膜。最后，將其與室溫下帶有HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000）孵育1 h。用Quantity One 2.6.2 圖像分析系統(tǒng)分析掃描圖像，以目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示。通過(guò)單因素方差分析ANOVA 和Tukey 事后多重檢驗(yàn)（組間兩兩比較）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能指標(biāo)比較

假手術(shù)組心肌的LVDP、+dp/dtmax和LVEDP顯著高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。與I/R組相比，粉防己堿組LVDP和+dp/dtmax顯著增加，而LVEDP顯著降低（P<0.05）。與粉防己堿組相比，粉防己堿+AG490組LVDP和+dp/dtmax顯著降低，而LVEDP顯著升高（P<0.05，表1）。

表1 心功能指標(biāo)的變化情況（±s）

表1 心功能指標(biāo)的變化情況（±s）

*P<0.05 vs 假手術(shù)組；#P<0.05 vs I/R 組；△P<0.05 vs 粉防己堿組

組別心率（bpm）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）+ dp/dt（mmHg/s）假手術(shù)組258.97±8.9771.36±5.868.25±2.052 667.05±225.00 I/R 組250.69±9.0846.51±6.29*16.67±1.95*1 636.26±297.95*粉防己堿組259.53±8.2958.37±7.17*#11.55±1.94*#2 291.96±211.52*#粉防己堿 +AG490 組249.92±10.8348.57±5.78*△16.75±1.66*△1 656.82±289.66*△

2.2 心肌梗死面積和LDH 釋放比較

假手術(shù)組的心肌梗死面積和LDH水平顯著低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖1）。與I/R組相比，粉防己堿組心肌梗死面積和LDH水平顯著減少（P<0.001）。與粉防己堿組相比，粉防己堿+AG490組心肌梗死面積和LDH水平顯著增加（P<0.05，圖1）。

圖1 粉防己堿給藥后減少心肌梗死面積和LDH 釋放

2.3 粉防己堿可增加I /R 后心肌中p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2 的水平，并降低Bax 的水平

與I/R 組相比，粉防己堿組p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.001），Bax 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.001）（圖2）。與粉防己堿組相比，粉防己堿+AG490 組p-JAK2、p-STAT3 和Bax蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.001），Bax 蛋白表達(dá)顯著上升（P<0.001，圖2）。

圖2 大鼠p-JAK2（B）、p-STAT3（C）、Bcl-2（D）和Bax（E）的表達(dá)定性（A）和定量（B～E）變化

2.4 粉防己堿改善心肌能量代謝

與假手術(shù)組相比，I/R 組心肌ATP 含量顯著降低（2.96±0.29 比7.87±0.35）。與I/R 組相比，粉防己堿組ATP 含量顯著升高（5.71±0.30 比2.96±0.29）（P<0.01），而粉防己堿+AG490 組和I/R 組之間ATP 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 線粒體ROS 產(chǎn)生率

與假手術(shù)組相比，I/R 組線粒體ROS 產(chǎn)生率顯著增加（13.13±1.58 比7.20±1.51），與I/R 組相比，粉防己堿組線粒體ROS 的產(chǎn)生率顯著降低（9.37±1.23 比13.13±1.58）（P<0.01）。與粉防己堿組相比，粉防己堿+AG490 組線粒體ROS 產(chǎn)生率顯著增加（13.11±0.29 比9.37±1.23）（P<0.01）。

3 討論

粉防己堿是一種天然的雙芐基異喹啉生物堿化合物，具有顯著的生物利用度，并具有抗癌作用、抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用，已用于治療心血管疾病和高血壓。研究證實(shí)，粉防己堿可提供良好的心肌保護(hù)，是一種有前途的心肌損傷治療方法[3]。本研究中粉防己堿能顯著改善心功能指標(biāo)，減少心肌梗死面積，研究結(jié)果證實(shí)粉防己堿可能起到良好的心保護(hù)作用。

據(jù)報(bào)道，活性氧涉及許多疾病，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心力衰竭和高血壓等[8]，其在心肌保護(hù)中起著雙重作用。在I /R 的早期階段，低水平的ROS可以激活多種保護(hù)性信號(hào)通路，而高水平的ROS可以引起心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。因此，有必要將線粒體ROS 的產(chǎn)生降至最低，以防止心肌細(xì)胞I/R 損傷[8]。本研究評(píng)估了粉防己堿對(duì)線粒體ROS的產(chǎn)生速率的影響，結(jié)果提示粉防己堿的心肌保護(hù)作用與抑制線粒體ROS 產(chǎn)生有關(guān)。

另外，線粒體是心肌I/R 期間ROS 的主要來(lái)源，有研究表明Bcl-2 表達(dá)的下調(diào)可能誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生[7]。本研究結(jié)果顯示粉防己堿上調(diào)Bcl-2 蛋白水平，并抑制Bax 蛋白水平。有研究顯示，粉防己堿治療可降低線粒體ROS 的產(chǎn)生并抑制促凋亡因子Bax 蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[3]。再灌注期間會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致心肌Ca2+超負(fù)荷，從而損害線粒體功能，誘導(dǎo)炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，特別是再灌注開(kāi)始后幾分鐘內(nèi)大量釋放的ROS 被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的主要誘因[9]。因此，推測(cè)粉防己堿可以通過(guò)降低ROS，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌I/R 損傷的重要因素[7]，先前研究表明，激活的JAK2 和STAT3 可保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡[7，10]。Zhang 等[11]報(bào)道粉防己堿可抑制心臟細(xì)胞模型中I/R 誘導(dǎo)的損傷，并與JAK3/STAT3/HK Ⅱ信號(hào)通路有關(guān)。JAK2-STAT3 信號(hào)通路是器官保護(hù)的重要組成部分，涉及心、大腦、腎和肝等許多器官[7，12-13]。JAK 家族由JAK1、JAK2、JAK3 和Tyk2 4 個(gè)成員組成，STAT 的磷酸化主要受JAK1、JAK2 和JAK3 調(diào)控[13]。本研究結(jié)果顯示粉防己堿顯著增加p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)，JAK2 選擇性抑制劑AG490 逆轉(zhuǎn)了粉防己堿對(duì)細(xì)胞凋亡和JAK2-STAT3 途徑的心保護(hù)作用。證實(shí)了粉防己堿激活了JAK2-STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)了Bcl-2蛋白水平，并下調(diào)了Bax 蛋白水平，最終抑制了心肌細(xì)胞凋亡，并減小了心肌梗死面積。

綜上所述，粉防己堿的心保護(hù)作用與JAK2-STAT3 的激活有關(guān)，粉防己堿給藥后p-JAK2 和p-STAT3 的表達(dá)增加，這可能使得線粒體ROS 生成減少和線粒體ATP 含量增加，從而減少了細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積。