顧晨露，王啟曉，田勝，李秀，童珊珊

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾之一，多種生物學(xué)功能都與其相關(guān)。蛋白質(zhì)糖基化可分為兩類：N-糖基化和O-糖基化。一般來(lái)說(shuō)，N-多聚糖附著在由Asn-X-Ser/Thr組成的特定氨基酸序列基序上，X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。O-多聚糖與絲氨酸或蘇氨酸相連，沒(méi)有任何特定的氨基酸序列基序。此外，N-聚糖有一個(gè)共同的核心結(jié)構(gòu)，由GlcNAc2Man3組成，而O-聚糖則有多個(gè)核心結(jié)構(gòu)[1-2]。由于糖基結(jié)構(gòu)的多樣性，蛋白經(jīng)糖基化修飾后結(jié)構(gòu)明顯更加復(fù)雜。蛋白質(zhì)糖基化的復(fù)雜性不僅在于聚糖結(jié)構(gòu)中單糖組成的改變，而且在于立體化學(xué)和糖基化位點(diǎn)的復(fù)雜多變[3]。多聚糖在細(xì)胞間通訊、細(xì)胞運(yùn)輸、蛋白質(zhì)溶解等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。蛋白質(zhì)糖基化可改變蛋白質(zhì)功能，糖基化過(guò)程的失調(diào)或紊亂與癌癥[5]、炎癥性疾病[6]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]等相關(guān)，如阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)。AD的主要病理特征為神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊。神經(jīng)纖維纏結(jié)由磷酸化的tau蛋白組成，斑塊由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)組成[7]。Sato等[8]通過(guò)單糖組成分析證實(shí)tau蛋白存在N-糖基化；Jacobsen等[9]也證實(shí)，O-糖基化導(dǎo)致APP生成過(guò)程中α型可溶性APP水平增加。

基于糖基化蛋白成分及結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，準(zhǔn)確地對(duì)糖基化蛋白定性、定量或糖基化位點(diǎn)分析，對(duì)于疾病標(biāo)志物的精準(zhǔn)檢測(cè)、進(jìn)一步從分子層面揭示疾病發(fā)生的機(jī)制顯得相當(dāng)重要。近年來(lái)發(fā)展了許多分析技術(shù)應(yīng)用于糖蛋白分析，如糖蛋白質(zhì)組學(xué)、表面等離子體共振成像法、多重質(zhì)譜等。

然而生物樣品中糖基化蛋白質(zhì)相對(duì)豐度低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，故而適宜的分離技術(shù)必不可少。親和技術(shù)具有良好的專一性和靈敏度，可有效實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離富集，其已成為糖基化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的有力工具，并在近期得到發(fā)展。親和分離技術(shù)是基于配基與底物之間的專一的可逆性結(jié)合，選擇性分離檢測(cè)目標(biāo)物的分離分析手段，在復(fù)雜的生物大分子分析中顯示出卓越的優(yōu)異性。由于細(xì)胞內(nèi)或生物基質(zhì)中糖基化蛋白質(zhì)的含量普遍很低，質(zhì)譜通常是分析蛋白質(zhì)糖基化的首選方法[10]。在質(zhì)譜分析之前，往往需要富集濃縮以降低背景干擾，提高親和分離效率。親和分離糖基化蛋白以實(shí)現(xiàn)富集目的，提高了糖基化蛋白質(zhì)鑒別的專一性和靈敏度。本文在近年來(lái)蛋白質(zhì)糖基化研究的基礎(chǔ)上，對(duì)糖蛋白分析的親和材料和方法進(jìn)行總結(jié)。

1 凝集素親和層析與凝集素芯片技術(shù)

目前已發(fā)現(xiàn)一千多種植物凝集素，王鈺清等[11]歸納了植物凝集素的類別，一般根據(jù)碳水化合物的結(jié)合特異性，可將凝集素分為D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基半乳糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-巖藻糖凝集素和N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)凝集素。與抗體不同，凝集素是一類非免疫來(lái)源的特異性糖蛋白，且其具有的糖結(jié)合位點(diǎn)能識(shí)別糖蛋白和糖肽中復(fù)雜的糖基結(jié)構(gòu)[12]，因此凝集素對(duì)含特異性糖基結(jié)構(gòu)的糖蛋白具有特異性的分子識(shí)別能力。

研究人員不斷嘗試設(shè)計(jì)一種良好的凝集素親和載體以選擇性分離糖蛋白，主流方法一般在瓊脂糖基質(zhì)上應(yīng)用固定化凝集素[13]。這種基質(zhì)的主要缺點(diǎn)是由于流速和回流壓力的限制，色譜條件受到嚴(yán)重限制。樣品往往需要預(yù)處理，大大增加了分析時(shí)間和樣品丟失的風(fēng)險(xiǎn)，從而影響分析結(jié)果。近年來(lái)，將凝集素固定于二氧化硅載體上，可制備出具有良好色譜性能的高壓凝集素柱。然而，二氧化硅微球的pH值限制和非特異性吸收是該研究的技術(shù)瓶頸[14]。多孔二氧化硅在堿性pH值下可被溶解，且其表面存在的硅醇基團(tuán)可能作為潛在的離子交換位點(diǎn)，影響色譜柱的專屬性，因此，在基質(zhì)與配基偶聯(lián)之前，必須對(duì)基質(zhì)表面進(jìn)行額外的衍生化修飾。以Madera等[15]研究為代表，首先經(jīng)過(guò)一系列的工作，制得醛改性二氧化硅微球，再利用還原性胺化反應(yīng)與凝集素偶聯(lián)，制得凝集素-二氧化硅親和色譜填料?；谶€原胺化的蛋白質(zhì)和醛改性二氧化硅材料的化學(xué)結(jié)合，反應(yīng)非?？焖佟ｋm然常用的偶聯(lián)反應(yīng)大多是在4℃過(guò)夜進(jìn)行，以增強(qiáng)配基的穩(wěn)定性，但該反應(yīng)在室溫下偶聯(lián)效果較好，偶聯(lián)率較高，且對(duì)凝集素結(jié)合活性無(wú)明顯不良影響。此外，李鳳等[16]以Fe3O4為磁性粒子與二氧化硅合成出一種新型的磁性納米粒子，伴刀豆凝集素A以共價(jià)鍵的形式交聯(lián)在粒子表面，應(yīng)用于人血清中特異性糖蛋白的親和富集。

利用凝集素親和性，可以根據(jù)糖蛋白的特性，很容易地分離結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和寡糖。凝集素親和色譜在蛋白質(zhì)組學(xué)分析之前可以針對(duì)特定類型的糖蛋白，有效地簡(jiǎn)化復(fù)雜的樣品[17]。此外，凝集素親和色譜已用于結(jié)合多種糖蛋白，并可以用于識(shí)別疾病標(biāo)志物[18]。大量研究證實(shí)，缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白是診斷酒精性肝病的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[19]。allo-A凝集素可與含有四唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白殘基的寡糖結(jié)合。在以allo-A凝集素建立的親和層析中，由于缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白缺失某些糖基末端鏈，以低親和力與allo-A結(jié)合，缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白在適宜的洗脫條件下可通過(guò)層析柱，而正常轉(zhuǎn)鐵蛋白則與層析柱內(nèi)的allo-A凝集素結(jié)合滯留于層析柱內(nèi)[20]。allo-A親和層析技術(shù)用于缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白的初步分離，實(shí)現(xiàn)其有效檢測(cè)，為酒精性肝病的診斷與治療提供了依據(jù)。

然而，基于凝集素特異性結(jié)合碳水化合物結(jié)構(gòu)的特性，凝集素親和層析只能選擇性地富集單一類型的聚糖結(jié)構(gòu)。例如，伴刀豆凝集素A選擇性結(jié)合具有甘露糖單元的多糖[21]，黑參凝集素選擇性結(jié)合具有N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)單元的多糖[22]，橙黃網(wǎng)胞盤(pán)菌凝集素選擇性結(jié)合具有海藻糖單元的多糖[23]。凝集素分離的主要缺點(diǎn)是，對(duì)于任何單一凝集素，只能純化具有特定糖基的單一糖肽。為了克服這個(gè)問(wèn)題，使用凝集素的組合來(lái)進(jìn)行更廣泛的聚糖富集。Guo等[24]使用凝集素芯片檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)粒子，以期獲得HCV粒子的N-聚糖譜；37個(gè)凝集素中有32個(gè)顯示出陽(yáng)性結(jié)合信號(hào)。其中，有4個(gè)凝集素的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，尤其雪花蓮凝集素信號(hào)最強(qiáng)，表明高甘露糖型N-聚糖是HCV粒子的主要糖基化形式； 10個(gè)凝集素與半乳糖/N-乙酰半乳糖胺結(jié)合，表明HCV粒子存在半乳糖基化的N-聚糖和O-鏈聚糖。凝集素芯片的應(yīng)用克服了單一凝集素選擇性結(jié)合的缺陷，有望用于高通量的聚糖篩選。

2 免疫沉淀技術(shù)

免疫沉淀可用于如血漿、細(xì)胞系、組織等生物基質(zhì)，以富集特定的糖蛋白，應(yīng)用于后續(xù)精密儀器分析，從而全面表征特定的糖蛋白。如圖1所示的分析策略，目標(biāo)糖蛋白經(jīng)免疫沉淀技術(shù)從復(fù)雜生物基質(zhì)中分離，經(jīng)酶消化，再加入碘甲烷等甲基化試劑使糖鏈甲基化，以應(yīng)用于質(zhì)譜等進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。

注：CID-MS/MS引用文獻(xiàn)[25]圖1 免疫親和純化糖蛋白及后續(xù)分析策略

Wang等[25]將該項(xiàng)技術(shù)用于分析肺癌細(xì)胞中的觸珠蛋白；抗體于肺癌患者血漿中孵育以去除血漿中免疫球蛋白，從而富集觸珠蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同樣，免疫沉淀富集分離技術(shù)也經(jīng)Tsai等[26]用于肺癌患者血清樣本中生物標(biāo)志物的篩選。然而，由于該方法依賴于特定抗體來(lái)識(shí)別目標(biāo)糖蛋白，應(yīng)用范圍較局限。

3 固定金屬離子色譜-親水作用色譜同步分離技術(shù)

以金屬離子為配基的色譜分離技術(shù)又稱固定金屬親和色譜(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)，其色譜基質(zhì)共價(jià)耦合某些能螯合金屬離子的化合物，而被特定螯合的金屬離子能與某些蛋白質(zhì)表面暴露的氨基酸殘基(主要是組氨酸)配位結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白質(zhì)的分離檢測(cè)。發(fā)展至今，研究者在前人基礎(chǔ)上不斷改革創(chuàng)新，使IMAC具備蛋白負(fù)載能力高、配基穩(wěn)定、洗脫條件溫和、成本低和再生簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。特別是IMAC的高選擇性使得其成為分子生物學(xué)研究中純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[27]。在親和填料方面，為獲得理想的選擇性并且減少金屬離子解吸附，學(xué)者們開(kāi)發(fā)多種IMAC配基，可分為四種類型：(1)雙齒配基，如氨基羥肟酸[28]；(2)三齒配基，如亞氨基二乙酸[29]；(3)四齒配基，包括氮三乙酸和羧甲基天冬氨酸[30]；(4)五齒配基，如四乙烯戊胺[31]。

IMAC和親水作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)作為可應(yīng)用于同時(shí)富集磷酸化蛋白和糖基化蛋白的技術(shù)手段，近年來(lái)取得較大進(jìn)展。Zhang等[32]利用Fe3+固定化離子色譜選擇性富集糖肽類和磷酸肽類，并在HILIC模式下進(jìn)一步分離。IMAC-HILIC技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于能夠同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化進(jìn)行分析，對(duì)于闡明蛋白的生物功能非常重要。在Zhang等[32]的研究中，糖肽和磷酸肽得到很好的富集，甚至從α-酪蛋白、胎球蛋白和牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化物中成功分離出兩個(gè)餾分。將建立的方法應(yīng)用到HeLa細(xì)胞裂解液中，分離檢測(cè)出1 903個(gè)磷酸肽和141個(gè)糖基化位點(diǎn)。由此表明，該方法可以選擇性、同時(shí)富集和分離肽混合物中的糖肽和磷酸肽。

4 硼酸親和整體柱及硼酸親和磁性納米粒

由于硼酸反應(yīng)的專一性，硼酸鹽親和材料近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。已證實(shí)硼酸鹽親和材料可以有效分離包括糖蛋白在內(nèi)的含順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物[33]。硼酸分子與糖鏈上的順式二羥基結(jié)構(gòu)在堿性條件下形成環(huán)酯，該生成物在酸性條件下容易水解[34]，反應(yīng)原理如圖2所示?；谠摽赡娣磻?yīng)，可利用硼酸鹽親和材料選擇性檢測(cè)分離富集糖基化蛋白。將硼酸鹽親和配體固定于整體柱[35]、磁性納米粒[36]等載體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白的分離富集。

圖2 硼酸鹽材料親和分離順式二羥基化合物原理圖

基于間氨基苯基硼酸(m-aminophenylboric acid, m-APBA)固定在瓊脂糖凝膠上的商業(yè)化硼酸鹽親和材料，可用于糖尿病相關(guān)的糖基化蛋白和糖基化肽分離[37]。然而，m-APBA與含有酪氨酸、蘇氨酸或絲氨酸殘基的肽之間存在一些非特異性作用，這將極大地影響該方法的分離效率[38]。為此，研究者將多種新型硼酸分子應(yīng)用于糖蛋白的分離富集，主要包括硼酸的雜環(huán)類似物、苯基上連有吸電子基的取代苯硼酸等[39]。例如，3-丁烯基磺?；?苯基硼酸整體毛細(xì)管柱可在中性pH位點(diǎn)親和結(jié)合核苷和糖蛋白[39]。

另一種硼酸親和分離糖基化蛋白的策略是將聚合硼酸與磁性納米顆粒結(jié)合，增強(qiáng)硼酸親和材料與糖蛋白的結(jié)合能力。Huang等[40]以唾液酸為模板，3-氨基苯基硼酸為功能單體，甲基丙烯酸甘油酯為共聚單體，制備硼酸親和磁性中空分子印跡聚合物。中空結(jié)構(gòu)使得化學(xué)吸附的Fe3O4納米顆粒在內(nèi)外表面有更多的結(jié)合位點(diǎn)，有利于模板分子從聚合物中脫除，增強(qiáng)對(duì)唾液酸的吸附能力。在最佳條件下，唾液酸的檢出限為2.5 ng/mL。該方法用于分析不同加標(biāo)水平的血清樣品時(shí)，唾液酸的加標(biāo)回收率為71%～106%。由此表明，硼酸親和磁性中空分子印跡聚合物對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中痕量唾液酸的選擇性和高效富集的優(yōu)越性，證實(shí)多價(jià)結(jié)合策略的可行性。

5 小結(jié)與展望

近年來(lái)，隨著糖蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，使用凝集素親和、免疫沉淀、離子色譜、硼酸親和等分離富集技術(shù)實(shí)現(xiàn)了低豐度糖蛋白的檢測(cè)，成為糖基化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的有力工具。盡管凝集素親和層析技術(shù)只能選擇性地富集單一類型聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白，但凝集素芯片技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了特定糖基結(jié)構(gòu)的高通量篩選；免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了血漿等復(fù)雜基質(zhì)中的糖蛋白分離富集；固定金屬親和色譜的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了磷酸化蛋白和糖基化蛋白的在線同步分離檢測(cè)；硼酸親和技術(shù)除了分離糖蛋白還可分離含順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物，改性硼酸的合成解決了硼酸親和材料堿性工作環(huán)境易使糖蛋白水解的問(wèn)題，聚合物載體的引入擴(kuò)增了硼酸配體的數(shù)目，從而提高了該親和材料對(duì)糖蛋白及糖肽的親和力，但合成過(guò)程中模板的選擇、功能單體及共聚單體的加樣比，以及合成路線對(duì)硼酸親和材料性能有較大影響。親和分離技術(shù)在蛋白質(zhì)糖基化修飾研究中的總結(jié)與展望如表1所示。

表1 親和分離技術(shù)在蛋白質(zhì)糖基化修飾研究中的總結(jié)與展望

此外，糖蛋白通常有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，這復(fù)雜化了位點(diǎn)特異性糖基化的表征。為獲得糖蛋白的微觀異質(zhì)性信息，亟須在親和分離技術(shù)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出專一性更好、靈敏度更高的檢測(cè)手段來(lái)獲取肽主鏈、糖基化位點(diǎn)等信息，從而揭示蛋白質(zhì)糖基化修飾的生物學(xué)效應(yīng)。