王菀葉

(南京市第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210006)

皮質(zhì)醇是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物，其過度分泌與庫欣綜合征有關(guān)，而皮質(zhì)醇缺乏與艾迪生病有關(guān)。皮質(zhì)醇參與了人體的葡萄糖代謝、血壓調(diào)節(jié)等基礎(chǔ)過程[1]，在人體功能良好運(yùn)轉(zhuǎn)中起到重要的作用。近年來，許多精神健康相關(guān)的研究也將皮質(zhì)醇檢測(cè)納入其中[2-3]。因此，血清皮質(zhì)醇檢測(cè)具有重要的臨床價(jià)值。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法是目前廣泛應(yīng)用的皮質(zhì)醇檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化程度高，檢測(cè)迅速快捷且重復(fù)性好，而免疫學(xué)檢測(cè)法主要的兩個(gè)缺點(diǎn)是特異性差和交叉反應(yīng)。由于皮質(zhì)醇主要是以與皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白(cortisol-binding globulin，CBG)結(jié)合的形式存在于血液循環(huán)中，免疫法檢測(cè)的皮質(zhì)醇濃度實(shí)際上大于血液中游離態(tài)的皮質(zhì)醇濃度[4]。而且?guī)煨谰C合征的女性患者數(shù)與男性患者數(shù)比為10 ∶1[5]，女性懷孕期間CBG明顯升高，因此，免疫學(xué)檢測(cè)方法并不能真實(shí)反映患者的皮質(zhì)醇水平。另外，可的松、 17α-羥孕酮(17α-OHP)和地塞米松對(duì)免疫法檢測(cè)有交叉反應(yīng)的干擾[6]。而異嗜性抗體等干擾物質(zhì)會(huì)使免疫學(xué)檢測(cè)到的皮質(zhì)醇濃度偏低[7]。相較而言，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)平臺(tái)對(duì)皮質(zhì)醇等類固醇物質(zhì)的檢測(cè)有更好的準(zhǔn)確性和特異性。美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(the National Institute of Standards and Technology，NIST)的Tai等[8]在HPLC-MS/MS平臺(tái)建立了血清皮質(zhì)醇的檢測(cè)方法，并提出將質(zhì)譜法作為檢測(cè)皮質(zhì)醇的參考方法。Keevil等[9]提出液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜平臺(tái)的高選擇性能強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，更加適合類固醇物質(zhì)的檢測(cè)。朱宇清等[10]建立并驗(yàn)證了質(zhì)譜方法適用于血清皮質(zhì)醇的檢測(cè)。鑒于目前國內(nèi)相關(guān)臨床檢測(cè)方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究報(bào)道較少，有必要開發(fā)和驗(yàn)證血清皮質(zhì)醇的HPLC-MS/MS分析規(guī)范，為建立中國人群的健康參考標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

本研究詳細(xì)介紹了在HPLC-MS/MS平臺(tái)上如何建立檢測(cè)血清皮質(zhì)醇的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化過程。在性能驗(yàn)證與質(zhì)量評(píng)估中，引入了Westgard等[11]推薦的六西格瑪分析，更直觀地對(duì)實(shí)驗(yàn)方法做出評(píng)價(jià)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理提供了更有針對(duì)性的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與質(zhì)控品

純皮質(zhì)醇凍干粉(批號(hào)Q3880-000)、皮質(zhì)醇-d4凍干粉(批號(hào)Q3880-040)為澳大利亞PM Separations公司產(chǎn)品；12個(gè)皮質(zhì)醇外部質(zhì)控樣品(編號(hào)為35-01至35-12)為澳大利亞皇家檢驗(yàn)學(xué)會(huì)質(zhì)控品(The Royal College of Pathologists of Australasia Quality Assurance Programs, RCPAQAP)，濃度依次為988，34，427，614，239，801，427，34，988，239，614和801 nmol/L，為美國賽默飛科技公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與耗材

1290 Infinity高效液相色譜儀，6490 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，Poroshell 120 EC-C18分析柱(3.0 mm×50 mm, 粒徑2.7 μm，批號(hào)B13236)均為美國安捷倫公司產(chǎn)品。甲醇(LC級(jí) 、批號(hào)1.06018.4000)，乙酸乙酯(批號(hào)1.00868.2500)，正己烷(LC級(jí)，批號(hào)1.04391.2500)均為德國默克集團(tuán)產(chǎn)品；甲基叔丁基醚(Methyl tert-butyl ether，MTBE)批號(hào)34875，為美國生命科學(xué)與高科技集團(tuán)公司產(chǎn)品；SeraCon類血清稀釋劑為澳大利亞Abacus ALS公司產(chǎn)品。

1.3 儲(chǔ)備液、工作液、標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品的制備

稱取純皮質(zhì)醇凍干粉0.010 2 g，加入500 mL甲醇中，制成濃度為56 280 nmol/L的皮質(zhì)醇儲(chǔ)備液；稱取皮質(zhì)醇-d4凍干粉0.002 g，加入1 000 mL甲醇中，制成濃度為5 580 nmol/L的內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液。將兩種儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于-18 ℃。

將355 μL 皮質(zhì)醇儲(chǔ)備液風(fēng)干后加入10 mL 類血清稀釋劑，制成濃度為2 000 nmol/L的皮質(zhì)醇工作液；取2 509 μL內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液加入7 491 μL甲醇，制成濃度為1 400 nmol/L的內(nèi)標(biāo)物工作液。用皮質(zhì)醇工作液和類血清稀釋劑配置6個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為0，400，800，1 200，1 600和2 000 nmol/L。低、中、高3個(gè)水平的質(zhì)控品濃度分別為100，500和1 500 nmol/L。

1.4 血清樣本的預(yù)處理

吸取血清樣本80 μL，水(LC級(jí))80 μL，甲醇80 μL，內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液80 μL，加入1.5 mL離心管內(nèi)，渦旋振蕩1 min，瞬時(shí)離心后加入液液萃取的溶劑1 mL，渦旋振蕩5 min, 室溫下3 000 r/min離心5 min，將500 μL上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL離心管中，36 ℃在生物安全柜內(nèi)風(fēng)干，用200 μL甲醇溶解后渦旋混勻20 s，轉(zhuǎn)入上樣瓶。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

使用正離子模式的電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，霧化氣體為氮?dú)猓F化氣壓力為60 psi，脫溶劑溫度為350 ℃，離子源溫度維持在150 ℃，錐孔電壓40 V。液液萃取的溶劑、碰撞能量、流動(dòng)相梯度、流速、柱溫與進(jìn)樣量分別通過詳細(xì)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選擇。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 液液萃取的溶劑選擇 使用正己烷、乙酸乙酯和MTBE溶劑做皮質(zhì)醇的液液萃取，比較皮質(zhì)醇峰的高度、形狀和背景干擾。本實(shí)驗(yàn)中正己烷未能萃取出皮質(zhì)醇，圖1比較了MTBE與乙酸乙酯萃取的皮質(zhì)醇峰，由于乙酸乙酯萃取出了疑似為同分異構(gòu)體的雜峰，被認(rèn)為萃取不穩(wěn)定，最終選取MTBE作為本實(shí)驗(yàn)的溶劑。

a： MTBE萃取的皮質(zhì)醇峰；b： 乙酸乙酯萃取的皮質(zhì)醇峰；c： 可能是長期儲(chǔ)存而產(chǎn)生的同分異構(gòu)體

2.1.2 碰撞能量的優(yōu)化 使用皮質(zhì)醇儲(chǔ)備液與內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液稀釋10倍后上樣，液相分析柱替換為普通連接柱，從而消除液相層面的干擾，記錄碰撞能量從15 eV到50 eV下離子的產(chǎn)量。結(jié)果如圖2所示，在30 eV下定量離子和定性離子的產(chǎn)生量均為最高。因此本實(shí)驗(yàn)中的皮質(zhì)醇的離子躍遷分別選擇為定量離子363 m/z→121 m/z 和定性離子363 m/z→97 m/z，碰撞能量為30 eV；而皮質(zhì)醇-d4的離子躍遷用同樣的方法確定為定量離子367 m/z→121 m/z，碰撞能量為 25 eV。

圖2 皮質(zhì)醇定量離子(363→121)和定性離子(363→97)在不同碰撞能量下的產(chǎn)量對(duì)比

2.1.3 流動(dòng)相成分與時(shí)間表 本實(shí)驗(yàn)液相色譜儀流動(dòng)相A的成分為2%甲醇溶液(含有0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為含有0.1%甲酸的甲醇。為了得到最優(yōu)的流動(dòng)相占比，從100%流動(dòng)相B開始，依次降低流動(dòng)相B的百分比，得到不同高度和寬度的皮質(zhì)醇等度洗脫峰。比較可得在流動(dòng)相B占90%時(shí)皮質(zhì)醇的洗脫為最優(yōu)(圖3)。考慮到皮質(zhì)醇的疏水性，在流動(dòng)相時(shí)間表的開頭和結(jié)尾需要使用盡可能少的流動(dòng)相B來減少丟失。綜合以上條件，則本實(shí)驗(yàn)中梯度流動(dòng)相設(shè)計(jì)為：0→2 min 35%B；2→4 min 35%B→90%B；4→6.5 min 90%B；6.5→8 min 100%B；8→8.5 min 100%B→35%B；8.5→11 min 35%B。

圖3 比較不同梯度的流動(dòng)相B洗脫得到的皮質(zhì)醇等度峰

2.1.4 流速、柱溫與進(jìn)樣量 本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了0.2, 0.3, 0.4和0.6 mL/min 4種流速，選擇了峰的高度和寬度最為理想的0.3 mL/min作為最終流速。相同流速下，分別測(cè)試2, 4, 5, 6, 7, 8和10 μL共7種進(jìn)樣量和45 ℃ 、20 ℃柱溫，最終選擇柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為6 μL，皮質(zhì)醇和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間為6.6 min。

2.1.5 離子抑制 為了排除磷脂的離子抑制作用的干擾，本實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)了184 m/z和104 m/z的出峰情況，得到磷脂的出峰時(shí)間為2 min，對(duì)皮質(zhì)醇及其內(nèi)標(biāo)物的檢測(cè)不存在干擾。

2.2 性能驗(yàn)證與質(zhì)量評(píng)估

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 皮質(zhì)醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=8.147×10-4X+0.003 44(r=0.999 9)，線性關(guān)系良好。使用RCPAQAP外部質(zhì)控品最低濃度(34 nmol/L),分別稀釋5倍、10倍、100倍各1對(duì)，檢測(cè)它們的信噪比(S/N)，用其中S/N比值均大于10的1對(duì)樣品(1 ∶10)的檢測(cè)濃度[12]，求得本實(shí)驗(yàn)中的最低定量下限為2.19 nmol/L。

2.2.2 精密度 同批次檢測(cè)步驟“1.3”中配置的低、中、高3個(gè)水平的質(zhì)控品各10個(gè)，得到批內(nèi)精密度為3.79%。將低、中、高3個(gè)水平的質(zhì)控品分5個(gè)批次檢測(cè)，得到批間精密度為7.48%。

2.2.3 偏倚(不確定度)與回歸分析 檢測(cè)12個(gè)RCPAQAP質(zhì)控品，將檢測(cè)值與靶濃度相比較做戴明回歸分析(圖4)，得到的方程為Y=1.096X+2.1，計(jì)算2個(gè)最接近皮質(zhì)醇醫(yī)學(xué)決定水平[13]的濃度的偏差，分別為9.90%和8.40%，它們的平均值9.15%為本實(shí)驗(yàn)方法的偏倚(不確定度)[14]。由此求得本實(shí)驗(yàn)方法的總誤差為21.49%。將已知濃度的2支RCPAQAP質(zhì)控品(614和239 nmol/L)等量相加，檢測(cè)3次，得到回收率為83%。

圖4 RCPAQAP外部質(zhì)控品的戴明回歸分析

2.2.4 六西格瑪分析 本實(shí)驗(yàn)使用六西格瑪質(zhì)量分析，用方程sigma=(總誤差-偏倚)/精密度進(jìn)行計(jì)算[11]。此處的允許總誤差參考美國CLIA′88能力驗(yàn)證計(jì)劃的分析質(zhì)量要求：皮質(zhì)醇的允許總誤差為靶值±25%。六西格瑪圖表使用允許精密度作為x軸，允許不確定度作為y軸，當(dāng)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法的sigma>4時(shí)，認(rèn)為是理想的實(shí)驗(yàn)方法，而sigma<3時(shí)認(rèn)為不在統(tǒng)計(jì)學(xué)程序控制范圍內(nèi)[15]。計(jì)算得到本實(shí)驗(yàn)方法的sigma為4.22，圖5顯示工作點(diǎn)落在4 sigma與5 sigma之間，說明本實(shí)驗(yàn)方法較為理想。

3 討論

不同溶劑與皮質(zhì)醇之間的親和力不同，提取效率不同，對(duì)人體的毒性也不同，因此液液萃取的溶劑對(duì)于產(chǎn)物的提純起到至關(guān)重要的作用。Honour[16]提出在選取溶劑時(shí)，檢測(cè)時(shí)長和溶劑的毒性也應(yīng)考慮在內(nèi)。因此最終選擇了峰形最好，提取最穩(wěn)定，毒性不算很強(qiáng)的MTBE作為液液萃取的溶劑。

實(shí)驗(yàn)中值得注意的是，為了防止降解的影響，工作液需要在每批次實(shí)驗(yàn)前用儲(chǔ)備液新鮮稀釋而成。皮質(zhì)醇-d4是本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物，由于甲醇可以起到沉淀蛋白的作用[17]，而內(nèi)標(biāo)物的濃度應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)(0～2 000 nmol/L)，因此使用甲醇配置了1 400 nmol/L的工作液。

MRM除了監(jiān)測(cè)定量離子、定性離子之外，還要監(jiān)測(cè)次顯著的離子躍遷[18]和離子抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，皮質(zhì)醇的檢測(cè)并沒有受到磷脂的離子抑制作用的影響。在今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化中，也可以監(jiān)測(cè)磷脂之外其他會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的脂類，如膽固醇、甘油酯[19]。

在本研究的流動(dòng)相時(shí)間表中，皮質(zhì)醇洗脫之前使用了35%的流動(dòng)相B，低于Jung等[20]和Hawley等[21]推薦使用的40%的流動(dòng)相B作為標(biāo)準(zhǔn)的解決方案。本研究小幅下調(diào)了流動(dòng)相B的比例，是考慮到皮質(zhì)醇的疏水性和液液萃取的設(shè)備較為簡(jiǎn)化，以此來規(guī)避可能出現(xiàn)的提取率不高的問題。Jung等[20]研究指出液液萃取的重構(gòu)步驟中使用的甲醇比例應(yīng)該與流動(dòng)相時(shí)間表的初始比例相一致，然而考慮到上樣小管在冷凍保存時(shí)純甲醇的穩(wěn)定性更優(yōu)，本研究重構(gòu)步驟使用了100%純甲醇以達(dá)到一個(gè)更精確易操作的重構(gòu)效果。

本研究在方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)得到批內(nèi)精密度和批間精密度分別為3.79%和7.48%。Biswas等[22]指出批間精密度更能代表實(shí)驗(yàn)方法的整體精密度，因此確定本方法的精密度為7.48%。從戴明回歸分析圖上可以看出，本研究中濃度高的樣品有產(chǎn)生更大偏倚的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)的精密度7.48%，偏倚9.15%，總誤差21.49%，均在Westgard數(shù)據(jù)庫列出的理想的生物學(xué)多樣性指標(biāo)范圍內(nèi)(精密度7.6%，偏倚10.26%，總誤差22.8%)，也符合美國CLIA′88能力驗(yàn)證計(jì)劃的分析質(zhì)量要求，并且在六西格瑪分析中得到了理想的結(jié)果。

值得提出的是，在精密度實(shí)驗(yàn)中使用的樣品濃度為100，500和1 500 nmol/L，這有可能為六西格瑪分析的計(jì)算帶來問題。Westgard建議驗(yàn)證精密度和不確定度的樣品濃度應(yīng)與醫(yī)學(xué)決定水平一致[23]?？紤]到RCPAQAP樣品的濃度更接近于醫(yī)學(xué)決定水平，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化可以使用同樣的RCPAQAP樣品做精密度和不確定度分析。

綜上所述，本研究在HPLC-MS/MS平臺(tái)上建立了血清皮質(zhì)醇的檢測(cè)方法，優(yōu)化了色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)的參數(shù)，并對(duì)其精密度、偏倚(不確定度)、定量限和六西格瑪分析等做了方法學(xué)驗(yàn)證與質(zhì)量評(píng)估，最終得到一個(gè)精密度高、準(zhǔn)確性好、理想且高效的策略。