施晉升, 王茂松, 李本忠, 張秀梅

(南京醫(yī)科大學康達學院附屬興化醫(yī)院心胸外科, 江蘇 興化 225700)

食管癌是我國最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第5位，死亡率居第4位。我國2018年食管癌新發(fā)患者和死亡患者分別為25.8萬和18.5萬，均占全球的55%左右[1-2]。食管癌的術后復發(fā)以及癌細胞的轉移是導致食管癌患者死亡的重要因素之一，而腫瘤血管形成與腫瘤的侵襲、浸潤和轉移密切相關，直接影響腫瘤患者的預后[3]。研究表明腫瘤細胞可產(chǎn)生血管形成因子，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，刺激毛細血管生長[4]。然而，腫瘤組織中調(diào)控血管內(nèi)皮細胞血管形成過程的具體機制尚不清楚[5]。外泌體是直徑為30～150 nm的細胞外囊泡，含有核酸、蛋白質(zhì)等多種生物大分子，作為細胞間信息交流的重要載體[6]，其在組織損傷和腫瘤發(fā)生發(fā)展、復發(fā)轉移的各個過程中發(fā)揮重要作用[7-12]。本研究擬觀察食管癌細胞EC109分泌的外泌體(EC109-ex)促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)血管形成的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

食管癌細胞株EC109和 HUVECs購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；H-DMEM、胎牛血清、胰酶(美國Gibco公司)；小鼠抗人CD9抗體、CD63抗體(德國Millipore公司)，小鼠抗人CD31抗體、兔抗人CD34抗體、兔抗人VEGF抗體(美國Abcam公司)；兔抗人β-肌動蛋白抗體、HRP標記山羊抗兔/小鼠IgG二抗(北京康為世紀生物科技有限公司)；CM-DiR染料(美國Invitrogen公司); hoechest33342染料(美國Sigma公司)；外泌體快速提取試劑(美國SBI公司)；BCA蛋白提取和濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Transwell小室(美國Corning公司); Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；PVDF膜、100 kDa MWCO超濾離心管(德國Millipore公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；ImageQuant LAS4000mini化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國GE公司); HT7800透射電鏡(日本HITACHI公司); TE300倒置式生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

EC109和HUVECs細胞采用含10 %胎牛血清的H-DMEM，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.3 EC109-ex提取

收集處于對數(shù)生長期的EC109細胞上清液，采用梯度-超速離心法提取EC109-ex。4 ℃、10 000×g離心30 min去除細胞碎片，上清液用100 kDa MWCO超濾管過濾；4 ℃、1 000×g離心30 min獲得含EC109-ex的濃縮液；加入外泌體快速提取試劑，4 ℃沉淀過夜；4 ℃、1 500×g離心30 min，收集沉淀，PBS洗滌后重懸于PBS，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 透射電鏡觀察EC109-ex結構

取50 μL EC109-ex滴于載樣銅網(wǎng)，室溫靜置2 min，滴加1%磷鎢酸溶液(pH=6.8)復染5 min，室溫風干后透射電鏡下觀察EC109-ex形態(tài)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測外泌體和血管形成標志蛋白表達

1.5.1 EC109-ex外泌體表面標志CD9、CD63檢測 取EC109-ex樣品，加入RIPA/PMSF/PIC蛋白裂解液，冰上搖床混勻10 min，超聲法裂解4次；4 ℃、15 000×g離心15 min，收集上清液獲得蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸10 min。取蛋白樣品50 μg進行10% SDS-PAGE，小鼠抗人CD9抗體(1 ∶500)、小鼠抗人CD63抗體(1 ∶500)、兔抗人β-肌動蛋白抗體(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜；TBS/T洗滌，加入HRP標記的山羊抗兔/小鼠IgG(1 ∶3 000)，37 ℃孵育1 h；TBS/T洗滌，超敏ECL發(fā)光法顯色，經(jīng)化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光并分析結果。

1.5.2 HUVECs血管標志蛋白檢測 HUVECs經(jīng)5 μg/mL和10 μg/mL EC109-ex處理48 h后，提取總蛋白，變性處理后，取蛋白樣品20 μg，經(jīng)電泳、轉膜、洗滌封閉，分別結合小鼠抗人CD31抗體(1 ∶1 000)、兔抗人CD34抗體(1 ∶1 000)、兔抗人β-肌動蛋白抗體(1 ∶2 000)、兔抗人VEGF抗體(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，洗滌，山羊抗兔/小鼠IgG(1 ∶3 000)孵育2 h，超敏ECL發(fā)光法檢測蛋白條帶。

1.6 HUVECs攝取CM-DiR染料標記的EC109-ex

CM-DiR染料(5 μL/mL)加入EC109-ex，充分混勻后于37 ℃避光孵育30 min。孵育結束后混合液轉移至100 kDa MWCO超濾離心管，加入10倍體積PBS，輕柔吹打混勻，4 ℃、1 500×g離心30 min，去除未結合的CM-DiR 染料，收集超濾離心管中的濃縮液，經(jīng)0.22 μm的濾器除菌后置于新的EP管中，即為CM-DiR染料標記EC109-ex。將HUVECs以3×104/mL密度接種于細胞玻片，待細胞完全貼壁后加入CM-DiR染料標記的EC109-ex，37 ℃孵育48 h。以4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌，加入Hoechst33342染核10 min，PBS洗滌，封片后采用熒光顯微鏡觀察CM-DiR標記的EC109-ex在HUVECs內(nèi)定位。

1.7 Transwell侵襲實驗

5 μg/mL和10 μg/mL EC109-ex處理24 h的HUVECs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，無胎牛血清H-DMEM制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×105/mL，充分混勻后，加入鋪有Matrigel膠的 Transwell小室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的H-DMEM，37 ℃培養(yǎng)12 h。取出Transwell小室，棉簽去除未透膜細胞，置于4%多聚甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色10 min，于顯微鏡下觀察拍照，隨機選取上下左右高倍鏡視野進行細胞計數(shù)。重復實驗5次，取每視野平均數(shù)作為實驗結果。

1.8 細胞成管實驗

吸取Matrigel基質(zhì)膠100 μL均勻平鋪于24孔細胞培養(yǎng)板孔底，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中3～4 h，使基質(zhì)膠充分凝固。胰蛋白酶消化HUVECs，用含10%胎牛血清的H-DMEM重懸細胞，終濃度為1.0×105/mL。實驗組加入5 μg/mL和10 μg/mL的EC109-ex，對照組加入等體積PBS。EC109-ex或PBS作用24 h后HUVECs(5.0×104個)均勻接種于基質(zhì)膠上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，倒置生物顯微鏡下觀察并拍攝管腔形成。重復實驗5次，采用Image J軟件對每組管樣結構的節(jié)點、血管分支數(shù)和總長度進行計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 EC109-ex的鑒定及EC109-ex在HUVECs內(nèi)的分布

透射電子顯微鏡觀察顯示，EC109-ex為球形的膜性小囊泡，膜結構完整，直徑為70～150 nm(圖1A)。蛋白質(zhì)印跡結果證實EC109-ex表達外泌體特異性標志物CD9和CD63(圖1B)。采用CM-DiR染料標記EC109-ex，進行外泌體攝取實驗，熒光顯微鏡下可見經(jīng)CM-DiR染料標記的EC109-ex分布在HUVECs胞質(zhì)及核周圍。表明EC109-ex可被HUVECs攝取(圖1C)。

A:透射電鏡觀察EC109-ex結構(×30 000); B: 蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體標志蛋白; C: 熒光顯微鏡觀察CM-DiR染料標記的EC109-ex在HUVECs內(nèi)分布(×400)

2.2 EC109-ex促進HUVECs的侵襲

Transwell實驗結果顯示，與對照組相比，EC109-ex 5 μg/mL刺激24 h后實驗組侵襲細胞數(shù)目顯著增加，而EC109-ex 10 μg/mL組侵襲細胞數(shù)目更多(圖2)。由此提示EC109-ex能夠顯著提升HUVECs的侵襲能力。

①：對照組；②：EC109-ex 5 μg/mL組；③：EC109-ex 10 μg/mL組。a: P<0.01，與對照組比較；b: P<0.01，與5 μg/mL組比較圖2 Transwell實驗檢測EC109-ex促進HUVECs的侵襲(×40)

2.3 EC109-ex促進HUVECs的小管形成

倒置生物顯微鏡觀察顯示，對照組HUVECs小管形成較少，僅可見不完全閉合的多邊形。而EC109-ex處理組含有閉合的管腔樣血管形態(tài)，EC109-ex 10 μg/mL組的成管腔樣血管形態(tài)較5 μg/mL組更加完整。與對照組相比，EC109-ex處理組的成管數(shù)、交叉點數(shù)明顯增加，EC109-ex 10 μg/mL組增加更加明顯。見圖3。結果表明EC109-ex可促進HUVECs的成管能力。

2.4 EC109-ex促進HUVECs血管形成特異標志表達

蛋白質(zhì)印跡結果顯示，與對照組相比，EC109-ex 5 μg/mL作用組HUVECs CD31、CD34表達上調(diào)，而10 μg/mL作用組CD31、CD34和VEGF表達都顯著上調(diào)，見圖4。由此表明EC109-ex可促進HUVECs的血管形成相關標志物的蛋白表達。

①：對照組；②：EC109-ex 5 μg/mL組；③：EC109-ex 10 μg/mL組。a: P<0.05，b: P<0.01，與對照組比較；c: P<0.01，與5 μg/mL組比較圖3 EC109-ex促進HUVECs的小管形成(×40)

①：對照組；②：EC109-ex 5 μg/mL組；③：EC109-ex 10 μg/mL組。a: P<0.01，與對應的對照組比較

3 討論

食管癌的發(fā)病率和致死率較高，總體預后差，5年生存率為15%～25%[1-2,13]。食管癌細胞的高侵襲性和易轉移性是影響患者預后的主要因素。血管生成在食管癌等腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和轉移過程中發(fā)揮著關鍵作用。腫瘤血管一方面為新生的腫瘤細胞提供新陳代謝所需的氧氣、蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，同時也可以促進腫瘤細胞從原發(fā)部位向遠處轉移、定居，導致腫瘤惡化[14]。研究表明，腫瘤細胞通過旁分泌效應調(diào)控血管周圍環(huán)境和內(nèi)皮細胞增殖、遷移。抑制食管癌血管新生是食管癌治療的重要組成部分。

外泌體含有來源細胞的各種核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細胞因子等[6, 15]，是細胞間通訊的信息載體。腫瘤細胞分泌的外泌體在腫瘤血管生成和轉移過程中發(fā)揮重要作用[9, 16]。研究表明乳腺癌細胞可通過外泌體向細胞外轉運miR-939，下調(diào)血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白，增加體外血管通透性[17]。結直腸癌外泌體可轉運miR-25-3p，下調(diào)內(nèi)皮細胞血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)、緊密連接蛋白(tight junction protein 1, TJP1)等表達，提高血管通透性[18]。缺氧條件可刺激肺癌細胞分泌外泌體，通過轉運miR-23a抑制內(nèi)皮細胞TJP1，增加血管通透性和癌細胞轉移[19]。也有研究表明，膠質(zhì)母細胞瘤[20]、肝癌[21]、胰腺癌[22-23]、鼻咽癌[24]和胃癌[25]等多種腫瘤細胞來源的外泌體含有各種長鏈非編碼RNA和蛋白質(zhì)，可誘導毛細血管出芽、新生，是新生血管形成的有效誘導劑。抑制腫瘤細胞來源的外泌體分泌，則可抑制腫瘤的增殖、遷移和腫瘤血管生成[26-27]。目前，有關食管癌細胞外泌體調(diào)控血管內(nèi)皮細胞成管的報道較少。本實驗研究結果表明，與對照組比較，EC109-ex在孵育30 min后即可被HUVECs成功攝入。EC109-ex作用后HUVECs的侵襲能力明顯提升，成管能力顯著增加。這些結果提示EC109-ex可進入血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞的侵襲和成管能力。

CD31、CD34是腫瘤研究中常用的血管內(nèi)皮細胞標志物[28]。同時，CD31存在于內(nèi)皮細胞間緊密連接處，參與血管生成和整合素的激活。CD34分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，選擇性地表達于人類及其他哺乳動物的內(nèi)皮細胞表面，在介導內(nèi)皮細胞間黏附中發(fā)揮著重要作用。VEGF可通過促進受體介導的毛細血管內(nèi)皮細胞增殖從而誘導毛細血管管腔形成，還可通過自分泌及旁分泌途徑引起血管通透性增加，改變腫瘤細胞間隙，在腫瘤細胞遷移和侵襲中起重要作用，是食管癌過度表達的血管新生刺激因子[29-30]。本研究結果證實EC109-ex能夠促進HUVECs的CD31、CD34和VEGF的蛋白表達，提示EC109-ex的促血管形成作用可能與其調(diào)控VEGF的表達有關。然而，EC109-ex在動物模型中是否具有類似的促血管效果需要進一步證實。此外，EC109-ex中發(fā)揮促血管形成的關鍵分子及其相關調(diào)控機制仍有待進一步探討。

綜上所述，本研究初步證實了食管癌細胞來源外泌體能夠進入內(nèi)皮細胞，誘導其侵襲、小管形成，并上調(diào)血管標志物和血管生長因子的表達。這為進一步靶向食管癌細胞釋放外泌體，建立食管癌治療的有效手段提供了重要的思路和方向。