馬翠， 湯郁， 程孟微， 史偉， 鄭文娟， 裘影影， 芮金兵， 王燕茹

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種臨床表現(xiàn)多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的慢性自身免疫性疾病[1]，B細(xì)胞異?；罨谷梭w產(chǎn)生大量自身抗體及免疫復(fù)合物是其主要發(fā)病機(jī)制[2]。相關(guān)研究指出CXC趨化因子受體4(CXCR4)與趨化因子CXCL12特異性結(jié)合形成CXCL12/CXCR4軸，啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，參與B細(xì)胞產(chǎn)生、分化及趨化作用，從而參與SLE的發(fā)生發(fā)展[3-4]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是一種多能、非造血的基質(zhì)前體細(xì)胞，具有顯著的多潛能分化和免疫調(diào)節(jié)特性[5]，廣泛用于移植治療多種疾病。有多個臨床研究證明異基因BMMSCs治療SLE可獲得較好的療效[6-7]，而關(guān)于其改善病情的機(jī)制尚待進(jìn)一步探究?，F(xiàn)有的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞輸注可能是通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子和下調(diào)輔助性T細(xì)胞17(T-helper cell 17，Th17)分化來實(shí)現(xiàn)對病情的控制[8]。間充質(zhì)干細(xì)胞改善病情與CXCR4相關(guān)的治療機(jī)制仍未見報道。本研究檢測BMMSCs輸注后MRL/lpr狼瘡鼠血漿IgG、C3水平，腎臟病理的改善以及狼瘡鼠B細(xì)胞、漿細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)的變化，旨在探究BMMSCs輸注改善SLE疾病活動與CXCR4之間的聯(lián)系，為控制SLE病情進(jìn)展提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

MRL/lpr鼠(SPF級)15只， 4～5周齡，雌性，購自上海靈暢生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2018-0003。C57BL/6 小鼠(SPF級)5只，6 周齡，雌性，購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2018-0012。實(shí)驗(yàn)小鼠于江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級飼養(yǎng)區(qū)飼養(yǎng)至20周齡。

胎牛血清、低糖DMEM 培養(yǎng)液(美國Sigma公司)；B220-PE(骨髓)，CD19-PE(外周血、脾臟)，CD138-APC熒光抗體(美國BD公司)；CXCR4-FITC熒光抗體、驢抗山羊IgG(美國Abcam公司)；流式細(xì)胞儀CANTO10C(美國BD公司);IgG、C3 ELISA試劑盒(美國SAB公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從C57BL/6小鼠的股骨和脛骨中沖洗出骨髓，將全部骨髓細(xì)胞置于含有20%胎牛血清的低糖DMEM中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。根據(jù)全骨髓貼壁篩選法獲取BMMSCs，培養(yǎng)48 h后全量換液，去除沒有貼壁的細(xì)胞，之后每3天半量換液1次。待原代細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。擴(kuò)增至第3代用于BMMSCs輸注實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組

實(shí)驗(yàn)動物分為4組，每組5只小鼠，分別為C57BL/6組(C57BL/6鼠未進(jìn)行尾靜脈輸注)、MRL/lpr組(MRL/lpr鼠未進(jìn)行尾靜脈輸注)、BMMSCs組(MRL/lpr 鼠于12周齡尾靜脈注射 BMMSCs)、PBS組(MRL/lpr鼠于12周齡尾靜脈注射PBS)；經(jīng)尾靜脈注射 BMMSCs的濃度為1×106個/mL PBS，按0.01 mL/g體重計算注射劑量，PBS組注射相同體積的PBS，所有動物統(tǒng)一在20周齡末處死。

1.4 ELISA法測定血漿C3和IgG濃度

取小鼠外周血500～1000 μL于EDTA抗凝管，2 500 r/min高速離心5 min，留取上層血漿200～400 μL，按SAB公司配套試劑盒說明書具體操作測定IgG、C3濃度。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血、骨髓和脾臟B細(xì)胞、漿細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)比例

經(jīng)各組小鼠眼球內(nèi)眥的眼眶靜脈叢采集外周血，從股骨和脛骨中分離骨髓，并取脾臟研磨過篩，使用含5%胎牛血清的PBS緩沖液重懸、離心，裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行有核細(xì)胞計數(shù)，每份標(biāo)本檢測1×106個細(xì)胞；在100 μL細(xì)胞懸液體系中，對B細(xì)胞-CD19/B220、漿細(xì)胞-CD138直標(biāo)熒光單抗4 ℃避光孵育20 min，CXCR4先于4 ℃孵育一抗20 min，洗滌后4 ℃避光孵育FITC熒光二抗20 min，于流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 HE染色觀察小鼠腎臟組織病理變化

分別將4組小鼠處死后取腎臟，首先經(jīng)過組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片等處理，再按照購自寶靈科公司的HE染色試劑盒操作說明進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎臟組織病理變化，最后拍照留存。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MRL/lpr狼瘡鼠與C57BL/6鼠血漿C3 、IgG濃度及B細(xì)胞、漿細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)差異

ELISA 結(jié)果顯示，MRL/lpr 組血漿中補(bǔ)體C3濃度較C57BL/6鼠明顯明顯降低(t=4.094，P<0.01)，IgG濃度明顯升高(t=3.997，P<0.01)。 見圖1。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，MRL/lpr組外周血CXCR4+CD19+細(xì)胞比例較C57BL/6鼠明顯降低(t=5.296，P<0.01)，CXCR4+CD138+細(xì)胞比例在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異；與C57BL/6鼠相比，MRL/lpr組骨髓CXCR4+B220+細(xì)胞比例(t=3.594，P<0.01)和CXCR4+CD138+細(xì)胞比例(t=3.486，P<0.05)均明顯升高；MRL/lpr組脾臟CXCR4+CD19+(t=4.021，P<0.01)和CXCR4+CD138+細(xì)胞比例(t=4.492，P<0.01)均明顯升高。見圖2。

圖1 ELISA檢測小鼠血漿C3、IgG濃度

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血、骨髓、脾臟B細(xì)胞和漿細(xì)胞CXCR4表達(dá)水平

2.2 BMMSCs輸注對MRL/lpr狼瘡鼠血漿C3、IgG濃度的影響

ELISA結(jié)果顯示，3組小鼠血漿C3濃度比較總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.92，P<0.01)，BMMSCs組較PBS組、MRL/lpr組血漿C3濃度明顯升高(P<0.01)；3組小鼠血漿IgG濃度比較總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.40，P<0.01)，BMMSCs組較PBS組、MRL/lpr組血漿IgG濃度均明顯降低(P<0.01)。見圖3。

*：P<0.01，與BMMSCs組比較圖3 輸注BMMSCs后MRL/lpr狼瘡鼠血漿C3、IgG濃度的變化

2.3 BMMSCs輸注對MRL/lpr狼瘡鼠B細(xì)胞、漿細(xì)胞表面CXCR4水平的影響

3組小鼠B細(xì)胞表面的CXCR4表達(dá)在外周血(F=7.43，P<0.05)，骨髓(F=14.54，P<0.01)和脾臟(F=12.84，P<0.01)的總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。BMMSCs組較PBS組B細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)在外周血明顯增加(P<0.01)，在骨髓(P<0.01)和脾臟(P<0.05)明顯下降；較MRL/lpr組在骨髓和脾臟表達(dá)均明顯下降(P均<0.01)。

3組小鼠漿細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)在骨髓(F=9.34，P<0.05)和脾臟(F=7.25，P<0.05)的總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 BMMSCs組較PBS組、MRL/lpr組漿細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)在骨髓和脾臟比例均明顯降低(P均<0.05)。而3組外周血CXCR4+CD138+細(xì)胞比例總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.13，P>0.05)。見圖4。

A：外周血；B：骨髓；C：脾臟。*：P<0.01，#：P<0.05，與BMMSCs組比較

CXCR4+漿細(xì)胞比例

2.4 BMMSCs輸注對MRL/lpr狼瘡鼠腎臟組織病理損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示，C57BL/6組腎臟結(jié)構(gòu)完整，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；MRL/lpr組腎臟組織破壞，腎小球、腎小管以及腎間質(zhì)均出現(xiàn)不同程度損傷，可見腎小球系膜增生、白細(xì)胞浸潤，腎小管出現(xiàn)腫脹、萎縮等改變，間質(zhì)局部少量纖維組織增生以及大量炎癥細(xì)胞浸潤。與PBS組、MRL/lpr組相比，BMMSCs組腎臟中腎小球系膜增生減輕，腎間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，腎小管腫脹程度減輕，總體上腎臟的病理損傷程度明顯改善。見圖5。

箭頭示大量炎性細(xì)胞浸潤的腎小球及腎間質(zhì)圖5 小鼠腎臟組織HE染色結(jié)果(×200)

3 討論

SLE是典型的慢性、全身性自身免疫疾病，研究表明SLE患者血漿C3和IgG水平高低及其變化程度與病情嚴(yán)重程度和變化密切相關(guān)[9]。MRL/lpr狼瘡模型鼠含有Fas基因隱性突變，與人類紅斑狼瘡相似，包括顯著的血清自身抗體、免疫復(fù)合物腎小球腎炎、血管炎等[10]，是較好的代表SLE的動物模型。本實(shí)驗(yàn)觀察到MRL/lpr狼瘡鼠血漿IgG濃度明顯高于正常對照組C57BL/6小鼠，C3較C57BL/6小鼠呈現(xiàn)顯著低水平，狼瘡鼠腎臟HE染色表現(xiàn)為腎小球、腎小管及腎間質(zhì)的多重?fù)p傷。這與SLE患者血漿IgG、補(bǔ)體C3較健康者的表達(dá)水平趨勢一致，也與狼瘡性腎炎患者的腎臟病理表現(xiàn)相近。

SLE臨床治療主要是以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主，盡管在治療策略和后期護(hù)理已有改進(jìn)，但該疾病仍呈現(xiàn)易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，甚至仍有部分患者因持續(xù)的免疫抑制治療及藥物不良反應(yīng)累積死于嚴(yán)重的出血及感染[11]。BMMSCs輸注作為新的治療手段已在臨床實(shí)行，因其低免疫原性、無免疫排斥的特點(diǎn)，已有多個臨床試驗(yàn)證明BMMSCs輸注能夠安全有效地改善SLE患者的病情，且自體移植和異體移植都易成功[6-7，12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMMSCs組較PBS組和MRL/lpr組小鼠血漿IgG水平降低，C3水平升高，且HE染色提示輸注BMMSCs后腎臟病理明顯改善。證明BMMSCs 輸注可以有效控制狼瘡鼠病情活動。

BMMSCs 輸注改善SLE病情的機(jī)制目前認(rèn)為主要為以下幾點(diǎn)：① 抑制包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的增殖與活化，影響免疫因子分泌[7]；② 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)的表達(dá)從而下調(diào)Th17水平以發(fā)揮療效[8]；③ 通過可溶性細(xì)胞因子影響B(tài)淋巴細(xì)胞表面趨化因子的表達(dá)[7]。近年來研究顯示，狼瘡患者的骨髓微環(huán)境存在一定缺陷，包括BMMSCs結(jié)構(gòu)異常及功能減退[13]、B細(xì)胞分化及遷移異常[4]、抗體分泌相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)紊亂[14]等。本研究顯示MRL/lpr 狼瘡鼠外周血B細(xì)胞CXCR4表達(dá)水平低下，在骨髓表達(dá)水平升高。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)SLE患者骨髓上清分泌更高水平的趨化因子CXCL12，提示狼瘡骨髓微環(huán)境存在多方面的缺陷。CXCR4作為CXCL12的受體，二者相互作用參與了SLE患者 B細(xì)胞活化、漿細(xì)胞的產(chǎn)生以及自身抗體的分泌[15]，由此推測狼瘡病情活動時骨髓內(nèi)環(huán)境可能分泌大量CXCL12，導(dǎo)致CXCR4+B細(xì)胞向骨髓遷移，因此在外周血中呈低水平。同時本研究中狼瘡鼠骨髓CXCR4+CD138+比例高于C57BL/6小鼠，這與Hanaoka等[4]、Ma等[16]研究中漿細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)結(jié)果相一致。漿細(xì)胞是B細(xì)胞活化的結(jié)果，有研究顯示骨髓漿細(xì)胞可能是狼瘡耐藥或者復(fù)發(fā)的原因之一[17]，骨髓CXCR4+CD138+細(xì)胞比例增高對SLE的意義有待深入研究。

有學(xué)者證實(shí)脾臟CXCL12、CD54及IL-6等聯(lián)合作用影響B(tài)細(xì)胞的遷移，并將漿細(xì)胞吸引至脾臟，促其保留和發(fā)揮功能[18]。Wang等[19]證實(shí)病情活動期小鼠脾臟高表達(dá)CXCL12。本研究中MRL/lpr狼瘡鼠脾臟CXCR4+CD19+細(xì)胞、CXCR4+CD138+細(xì)胞比例較C57BL/6小鼠均明顯升高，再次證明了CXCR4-CXCL12相互作用參與狼瘡鼠疾病活動。

本研究進(jìn)一步比較了MRL/lpr狼瘡鼠輸注BMMSCs后外周血、骨髓及脾臟中CXCR4+B細(xì)胞、CXCR4+漿細(xì)胞比例的差異，結(jié)果顯示，輸注BMMSCs后CXCR4+B細(xì)胞比例在外周血表達(dá)增高，在骨髓、脾臟中明顯下降；同時，輸注BMMSCs可顯著降低骨髓、脾臟中CXCR4+漿細(xì)胞比例。因此，我們推測BMMSCs輸注可能通過糾正MRL/lpr狼瘡鼠B細(xì)胞、漿細(xì)胞表面CXCR4的異常表達(dá)，減少自身抗體分泌、降低IgG水平以及增加C3等免疫復(fù)合物的產(chǎn)生，從而改善腎臟損傷，減緩病情的進(jìn)展。

綜上所述，本研究結(jié)果表明狼瘡鼠CXCR4+B細(xì)胞、CXCR4+漿細(xì)胞在外周血、骨髓及脾臟中分布異常，同種異體BMMSCs輸注可糾正其分布。本研究對BMMSCs輸注治療改善狼瘡疾病活動與CXCR4相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探索，為SLE患者的治療提供了新思路。