李紅，唐煒，呂進(jìn)泉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

雙?？虏《緦?parechovirus)被分為A、B、C、D、E、F 6種，其中parechovirus A又叫人雙埃柯病毒(human parechovirus，HPeV)，被細(xì)分為HPeV-1至HPeV-19基因型。HPeV是一種無包膜的病毒，其單鏈正向RNA基因組長度約為7.35 kb，包括1個開放閱讀框(open reading frame，ORF)[1]。HPeV在兒童中廣泛流行，可在多種兒童疾病(皮疹、腦炎、腦膜炎、膿毒癥，甚至嚴(yán)重的擴(kuò)張型心肌病)中檢測出該病毒[2]。近年來，HPeV引起新生兒神經(jīng)系統(tǒng)感染及敗血癥病例報告逐漸增多[3-5]，研究表明HPeV可能與嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延遲相關(guān)[6]。

感染HPeV的兒童可表現(xiàn)為非特異性癥狀或無癥狀，常在病原檢測時發(fā)現(xiàn)。目前病毒感染主要依據(jù)實驗室檢測，包括病毒抗體檢測、PCR及病毒培養(yǎng)等技術(shù)，主要針對已知病毒檢測，對于新病毒及高度變異病毒具有一定局限性。HPeV基因組高度可變，給臨床檢測工作帶來一定的困難。

病毒宏基因組學(xué)方法可以獲得樣本中所有的病毒核酸，具有了解樣本病毒群落組成以及探索新病毒和高度變異病毒的優(yōu)勢[7]。本研究采集新生兒糞便樣本，利用病毒宏基因組學(xué)方法檢測HPeV，并對HPeV分子特性進(jìn)行初步研究。利用巢氏PCR對新生兒糞便、血液及鼻咽分泌物進(jìn)行HPeV檢測，分析HPeV在新生兒中的流行情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年9月至2018年12月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科出生的新生兒195例：早產(chǎn)兒18例，足月兒177例；采集樣本時新生兒日齡3～7 d 60例， 8～14 d 72例，15～28 d 63例；其中男105例，女90例。

1.2 樣本采集

使用一次性無RNA酶離心管采集新生兒糞便、血液及鼻咽分泌物樣本各95份，儲存于-80 ℃冰箱。在獲得每位新生兒父母的知情書面同意后采集樣本。

1.3 病毒宏基因組文庫構(gòu)建

隨機(jī)選取45份糞便樣本，運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)構(gòu)建文庫，將45份樣本隨機(jī)分為5組，每組9個樣本，文庫名分別標(biāo)記為newbornfeces38、newbornfeces39、newbornfeces40、newbornfeces41以及newbornfeces42。病毒宏基因組DNA文庫構(gòu)建及生物信息學(xué)分析方法參考文獻(xiàn)[8-9]。

1.3.1 DNA文庫構(gòu)建 從-80 ℃冰箱中取出樣本置于冰上備用，用杜氏磷酸緩沖液將樣本按照1 ∶5比例重懸，冰上靜置10 min，期間振蕩3次，12 000×g、4 ℃離心5 min。取300 μL上清液至新的1.5 mL 離心管中，保存待用。將各個文庫中每個樣本取100 μL制備成500 μL混合體系，用0.45 μm濾菌器(美國Millipore 公司)過濾懸液，以去除真核細(xì)胞、細(xì)菌及微小顆粒物質(zhì)。利用核酸酶(美國Life Technologie公司)去除各文庫中無衣殼蛋白保護(hù)的游離核酸，用核酸提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取病毒核酸，使用文庫RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologic 公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將文庫中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用Klenow 大片段DNA 聚合酶(美國New England Biolabs 公司)將單鏈DNA合成雙鏈DNA，使用Viral metagenomics試劑盒(美國Illumina公司)構(gòu)建DNA文庫。

1.3.2 文庫純化與深度測序 將制備完成的DNA文庫利用文庫接頭試劑盒(美國Illumina 公司)加上接頭后進(jìn)行擴(kuò)增，接著采用Qiaquick PCR純化試劑盒(德國Qiagen公司)對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并采用Ampure Beads(美國Beckman公司)除去文庫中小的DNA片段和引物二聚體，從而獲得長度在300～800 bp的DNA文庫，送至上海生工生物有限公司Illumina Hiseq測序平臺進(jìn)行深度測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 通過Hiseq平臺對文庫進(jìn)行測序，運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)實驗分析平臺對測序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)各樣品條碼將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分類并輸出，利用Bowite 2軟件除去真核及原核基因序列，再利用VecScreen軟件剪切掉序列兩端的引物和接頭，將純凈的序列組裝拼接形成重疊群，進(jìn)行BlastX搜索，從本地病毒蛋白數(shù)據(jù)庫和本地非病毒蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。

1.4 全基因組獲取

選取文庫原始數(shù)據(jù)中病毒較長重疊群作為參考序列，利用Geneious 11.1.2軟件在各個文庫原始數(shù)據(jù)中進(jìn)行組裝，從而獲取全基因組。

1.5 獲得的HPeV毒株系統(tǒng)發(fā)育及重組分析

從GenBank數(shù)據(jù)中檢索了44條與本研究鑒定的HPeV相關(guān)且具代表性毒株的全基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。使用Mega 7.0進(jìn)行序列多重比對，以及MrBayes 3.2.7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

從GenBank中檢索相關(guān)基因組，并使用Mega 7.0進(jìn)行序列多重比對，再使用RDP4.0評估重組事件[10]。通過軟件SimPlot 3.5.1中的相似圖分析所識別的基因組涉及的重組事件[11]。根據(jù)重組區(qū)域再次進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定重組事件。

1.6 HPeV陽性樣本PCR篩查

依據(jù)上述研究獲得的重組HPeV毒株的衣殼蛋白核酸序列，使用Geneious 11.1.2設(shè)計巢式 PCR引物，對構(gòu)建文庫的糞便樣本45份以及其他新生兒鼻咽分泌物樣本95份、血液樣本95份、糞便樣本50份，共285份樣本進(jìn)行陽性篩選。外套上游：ACCAGACTGGGTCATTGAG；外套下游：CCTTGCAAGAAG-GCGACAAC；內(nèi)套上游：ACCCTTAGTCAACACCAGGC；內(nèi)套下游：GGACAGACAAGCAGTGGTCA。外套PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min，隨后94 ℃變性20 s，50 ℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。內(nèi)套PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min，隨后94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳目的片段位于306 bp。

2 結(jié)果

2.1 病毒宏基因組文庫生物信息分析

通過生物信息學(xué)分析，成功獲得5個文庫的病毒核酸序列，文庫newbornfeces38至newbornfeces42分別檢測出248 534、277 432、398 756、475 408、130 634條病毒序列，將原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI 的序列讀長檔案(sequence read archive，SRA)數(shù)據(jù)庫，登錄號為SRX7061110、SRX7063036、SRX7067008、SRX7070136、SRX7070288。在文庫newbornfeces40和newbornfeces41分別檢測630和1 792條HPeV序列。將文庫newbornfeces41的原始序列進(jìn)行組裝，獲得長度為7 207 bp的完整基因組，命名為newborn_zjlh，并預(yù)測該基因組包含一個編碼多聚蛋白的ORF。已將其全基因組序列上傳至 GenBank，登錄號為MT157224。

2.2 HPeV全基因組分析

HPeV毒株基因組全長為7 207 bp，線性，兩端為非編碼區(qū)，GC含量39.7%，包含一個長度為6 540 bp的ORF，起始于639 bp止于7 178 bp，預(yù)測編碼由2 179個氨基酸組成的多聚蛋白。P1、P2、P3是組成HPeV 多聚蛋白的3個多肽(圖1)。

5′UTR: 5′端非編碼區(qū)；3′UTR：3′端非編碼區(qū)；RdRp：依賴于RNA的RNA聚合酶

2.3 HPeV系統(tǒng)進(jìn)化分析及重組分析

基于HPeV全基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，來自新生兒糞便的HPeV屬于HPeV-1，與其他HPeV-1緊密聚類在一起(圖2A)。用newborn_zjlh不同區(qū)域基因序列進(jìn)行BlastN，結(jié)果顯示P1和P2基因區(qū)與HPeV-1關(guān)系密切，而P3基因區(qū)序列與HPeV-5同源性最高，提示newborn_zjlh可能是基因型間重組的結(jié)果。重組分析結(jié)果證實newborn_zjlh是HPeV-1 和 HPeV-5基因間重組的結(jié)果(圖2B)?；诓煌瑓^(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步證實了這一結(jié)果，以P1和P2區(qū)域為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示newborn_zjlh聚集在HPeV-1組中(圖2C、D)，以P3區(qū)域為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示newborn_zjlh與一株HPeV-5密切相關(guān)(圖2E)。為了計算并驗證重組區(qū)域的界限，利用Geneious 11.1.2軟件，將newborn_zjlh全基因組作為參考序列，結(jié)合文庫 newbornfeces41原始序列重新組裝，發(fā)現(xiàn)重疊群覆蓋邊界以及產(chǎn)生的序列(圖3)完全覆蓋newborn_zjlh全基因組，這表明newborn_zjlh毒株重組事件是在新生兒糞便中自然發(fā)生。

2.4 HPeV陽性樣本篩查

對糞便、血液及鼻咽分泌物樣本進(jìn)行巢氏PCR及1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示6份糞便樣本出現(xiàn)目的條帶，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BlastN驗證均為HPeV。HPeV在新生兒消化道感染率為6.3%。

3 討論

目前研究認(rèn)為HPeV是嬰幼兒感染的常見病原。HPeV主要通過糞便-口腔和呼吸道途徑傳播[12]，常在呼吸道分泌物及糞便樣本中檢測到該病毒[13]。本研究在95例新生兒糞便中檢出6例HPeV陽性(6.3%)，并獲得一個具有代表性的全基因組，分析顯示其在HPeV-1和HPeV-5基因型間重組?；蛑亟M是導(dǎo)致HPeV遺傳多樣性的一個常見原因[14]，本研究也證實這種進(jìn)程在人體可自然發(fā)生。HPeV-1和HPeV-5在世界各地廣泛流行，兒童腹瀉和腸胃炎中檢出率較高[15]。同時，有臨床研究證實，HPeV-1和HPeV-5與3歲以下兒童的散發(fā)性癱瘓病例相關(guān)[16]。分析6例HPeV陽性新生兒臨床資料，并沒有腸道感染癥狀及神經(jīng)系統(tǒng)感染證據(jù)。此次鑒定的HPeV毒株的致病性是否與HPeV-1或HPeV-5相同，還有待進(jìn)一步研究。此外，有研究報道，嬰幼兒早期感染HPeV與其3歲時的行為問題相關(guān)[17]，并在3個先天性畸形的嬰兒中檢測出HPeV[18]。因此，應(yīng)觀察并追蹤新生兒期感染HPeV的危害及其與嬰幼兒疾病的相關(guān)性。同時，對母嬰合并感染HPeV的情況進(jìn)行研究也是有必要的。

A：基于本研究鑒定的newborn_zjlh和其他具有代表性毒株的全基因組進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析；B：分析newborn_zjlh基因組與相關(guān)毒株基因組的重組結(jié)果；不同的顏色代表推定的重組區(qū)；C、D、E：基于不同重組區(qū)域基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析

A：newborn_zjlh全基因組堿基序列與原始序列進(jìn)行組裝后產(chǎn)生的序列；B：newborn_zjlh全基因組堿基序列；C：文庫 newbornfeces41原始序列圖3 HPeV原始序列映射至newborn_zjlh全基因組

本研究獲得一株HPeV毒株基因組，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，它與HPeV-1聚類。重組分析顯示其基因是重組而成，基因組全長7 207 bp，GC含量39.7%，包含一個長度為6 540 bp的ORF。利用ORF在GenBank進(jìn)行BlastP比對，與其同源性最高的5株 HPeV-1來自中國不同地區(qū)(GenBank號：AID67141、AMR08592、AMR08588、AOT85832、AQX36833)，且均從人體樣本檢出。本研究在調(diào)查血液及呼吸道樣本時未檢測出HPeV。已有研究表明，在呼吸道感染性疾病兒童中，HPeV檢出率可達(dá)8.8%[18]。這與本研究結(jié)果差距較大，推測其可能與新生兒接觸外部環(huán)境時間及空間受限相關(guān)。

本研究顯示HPeV可在新生兒中流行，而且主要是腸道感染，其危害性尚需進(jìn)一步追蹤觀察。