孫 健 高 敏 李 璟 鄭 宇

1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系，北京102442；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100083；3.北京市房山區(qū)新農(nóng)村建設(shè)服務(wù)中心，北京102440

抗生素在防治仔豬斷奶應(yīng)激及消化系統(tǒng)疾病方面發(fā)揮了重要作用，但抗生素的不當(dāng)使用和濫用也引起了病原菌耐藥、獸藥殘留和環(huán)境污染等問題。為了消除抗生素濫用帶來的系列問題，國(guó)家實(shí)施了飼料端“禁抗”、養(yǎng)殖端“限抗”的政策，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中尋找抗生素替代品已變得極為迫切。

抗菌肽，又稱為宿主防御肽，可保護(hù)腸道免受外來病原體的侵襲，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用，由于其具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是“替抗”或“減抗”的希望[1]。但由于生產(chǎn)成本及技術(shù)方面的原因，抗菌肽尚不能大規(guī)模生產(chǎn)。精氨酸作為一種半必需氨基酸，在維持腸道物理屏障功能、緩解氧化應(yīng)激損傷和增強(qiáng)免疫方面具有重要作用[2]。有研究[3-4]表明，氨基酸、益生菌、維生素和多糖類等日糧中的營(yíng)養(yǎng)成分可不同程度誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)，但精氨酸作為抗菌肽誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)豬腸道抗菌肽表達(dá)的研究尚不多見。因此，本試驗(yàn)擬通過細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證精氨酸對(duì)抗菌肽表達(dá)的誘導(dǎo)作用，研究精氨酸對(duì)抗菌肽β-防御素-1（pBD1）、β-防御素-2（pBD2）和β-防御素-3（pBD3）和PR39 基因表達(dá)的影響，旨在為抗菌肽進(jìn)一步用于生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）主要試劑。IPEC-J2 細(xì)胞由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心惠贈(zèng)；DEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、L-精氨酸、胰酶溶液，購自美國(guó)Gibco 公司；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生物科技公司；熒光定量試劑盒，購自北京康為世紀(jì)科技有限公司（CW0957M）。

2）主要設(shè)備。二氧化碳培養(yǎng)箱，購自美國(guó)Ther?mo 公司；超凈工作臺(tái)，購自江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡，購自日本Nikon 公司；PCR 儀，購自美國(guó)BIO-RAD 公司；熒光定量PCR 儀，購自美國(guó)羅氏公司。

1.2 方 法

1）IPEC-J2 細(xì)胞培養(yǎng)與精氨酸添加。IPEC-J2細(xì)胞鋪滿6 孔板底層80%時(shí)用于試驗(yàn)，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理，試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿底層80%時(shí)更換培養(yǎng)基，添加精氨酸，使培養(yǎng)基內(nèi)L-精氨酸的終質(zhì)量濃度分別為200、100、50 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。

2）細(xì)胞總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄。嚴(yán)格按總RNA 提取試劑盒說明書操作，用Nano Drop 測(cè)定RNA 純度和濃度，樣品A260nm/A280nm比值為1.8～2.0，保存?zhèn)溆谩Ｓ?%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量。電泳條帶清晰者，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）PCR 引物設(shè)計(jì)與合成。參照GenBank 中所提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，內(nèi)參為GAPDH，目的基因與內(nèi)參基因引物由公司合成（表1）。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物序列

4）熒光定量PCR 檢測(cè)pBD1、pBD2、pBD3 和PR39 基因mRNA 表達(dá)水平。用熒光定量PCR 儀檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組pBD1、pBD2、pBD3 和PR39 基因表達(dá)水平，采用20μL體系（表2），反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表2 熒光量PCR反應(yīng)體系

5）數(shù)據(jù)處理。按照基因的相對(duì)表達(dá)水平＝2-△△CT，計(jì)算對(duì)照組與試驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)水平，采用GraphPad Prism 8分析做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度精氨酸對(duì)β-防御素-1表達(dá)的影響

200、100、50μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度精氨酸均可促進(jìn)pBD1 的表達(dá)，并呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖1）。

圖1 不同濃度精氨酸對(duì)pBD-1表達(dá)的影響

2.2 不同濃度精氨酸對(duì)β-防御素-2表達(dá)的影響

200、100、50μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度精氨酸均可促進(jìn)β-防御素-2的表達(dá)，并且與培養(yǎng)基中添加精氨酸的濃度呈正相關(guān)（圖2）。

圖2 不同濃度精氨酸對(duì)pBD-2表達(dá)的影響

2.3 不同濃度精氨酸對(duì)β-防御素3表達(dá)的影響

200、100、50μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度精氨酸均可促進(jìn)pBD3的表達(dá)，中質(zhì)量濃度的精氨酸對(duì)pBD3的表達(dá)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)（圖3）。

圖3 不同濃度精氨酸對(duì)pBD-3表達(dá)的影響

2.4 不同濃度精氨酸對(duì)PR39表達(dá)的影響

200、100、50μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度的精氨酸對(duì)PR-39表達(dá)的調(diào)控作用不明顯（圖4）。

圖4 不同濃度精氨酸對(duì)PR39表達(dá)的影響

3 討 論

β-防御素在腸道疾病發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用，其水平的降低或功能障礙有可能導(dǎo)致炎癥性腸病。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，L-精氨酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞β防御素基因的表達(dá)具有明顯誘導(dǎo)作用，而且調(diào)控作用與精氨酸的濃度呈一定的相關(guān)性，尤其是β-防御素-2的表達(dá)受L-精氨酸的調(diào)控作用更為明顯。Han等[5]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎模型小鼠日糧中添加豬β-防御素-2可降低炎癥因子的產(chǎn)生，提高緊密連接蛋白、黏蛋白轉(zhuǎn)錄水平，減輕炎癥反應(yīng)。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，通過日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以調(diào)控內(nèi)源抗菌肽的表達(dá)水平，該方法或許是防治炎癥性腸病的策略之一[6]。

精氨酸對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞β 防御素基因表達(dá)的調(diào)控作用要比PR39明顯，這說明不同抗菌肽基因?qū)?nèi)源性物質(zhì)的調(diào)控敏感性存在差異，其機(jī)理和作用途徑也存在顯著差異。Lan 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸可通過誘導(dǎo)防御素的表達(dá)來緩解LPS 誘導(dǎo)的炎癥性腸病，其作用途徑可能與精氨酸激活mTOR 有關(guān)[6]，但其作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。