張旦旦，王煜，李卓，田瑩，王犖，毛俊霞，王許波，常亞青，郝振林

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

香螺Neptuneacumingii隸屬于軟體動物門Mollusca腹足綱Gastropoda新腹足目Neogastropoda蛾螺科Buccinida，其殼近菱形，殼質(zhì)堅硬，顏色為淺褐色，螺層約為7層[1]。香螺為冷水性大型種類，其肉質(zhì)鮮美肥嫩，營養(yǎng)豐富，富含有人體必需的微量元素[2]。香螺肉可加工成干制品，也可鮮食，深受人們喜愛[3]，市場價格近120元/kg，經(jīng)濟價值較高，是非常具有增養(yǎng)殖潛力的螺類。香螺分布范圍較小，在中國主要分布于黃、渤海海域[4-5]，日本、朝鮮海域也有分布[6]。

目前，關(guān)于香螺的研究較少，主要集中于香螺殼質(zhì)[7]、營養(yǎng)元素[8]、繁殖生物學(xué)[9]等方面。近年來，有學(xué)者初步開展了香螺遺傳多樣性的研究，隋娜[10]基于微衛(wèi)星標記的方法研究了遼寧及山東5個地理群體香螺的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)地理位置與遺傳多樣性存在一定的聯(lián)系。日本學(xué)者Azuma等[11]利用分離的多態(tài)微衛(wèi)星標記技術(shù)分析了日本北海道海域香螺種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)基因可用于鑒定香螺種群和親緣關(guān)系。然而微衛(wèi)星技術(shù)在PCR擴增時可能會出現(xiàn)無效基因的情況，進而影響群體的鑒定結(jié)果[12]。本研究中，通過分析中國黃、渤海海域6個不同地理群體香螺COXⅠ和CYTB基因的遺傳多樣性水平，試圖明確中國香螺遺傳多樣性水平和種質(zhì)遺傳背景，旨在為香螺健康養(yǎng)殖及其資源保護和種質(zhì)管理提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用香螺于2017年6—10月采自大連市大連灣(DL)、大連市獐子島縣(ZZ)、大連市旅順鹽場(LS)、煙臺市八角港(YT)、威海市(WH)、蓬萊市長島縣(PL)6個海域，樣本各10尾，用保溫箱運回至大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。解剖，剪取每尾個體的腹足肌組織，用過濾海水洗凈，稱重，并于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、COXⅠ和CYTB基因擴增及測序 剪取香螺腹足肌組織約20 mg，剪碎并裝入離心管。采用TIANGEN 海洋動物基因組提取試劑盒提取DNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用紫外分光光度計測量DNA的質(zhì)量和濃度，于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

香螺線粒體COXⅠ基因擴增引物為

F：5′ATGCGTTGATTATTTTCKACAAATCA 3′；

R：5′TCTTGAAATCCTARTTGTCCTCATAG 3′。

線粒體CYTB基因擴增引物為

F：5′CTTCCCTTCGTCCTTTCAAT 3′；

R：5′GACAAATATTCCCCAGGAATAAC 3′。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：10×Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)5 μL，上、下游引物各2 μL(10 μmol/L)，模板DNA(50 μg/μL)5 μL，ddH2O 31 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，50 ℃(COXⅠ基因)或55 ℃(CYTB基因)下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸120 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，在4 ℃下保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物并送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.2.2 序列分析 使用BioEit軟件對測序結(jié)果進行比對。采用BLAST檢索確定目的基因。采用DNASP 5.0(DNA Sequence Polymorphism)軟件確認單倍型數(shù)，計算6個不同海域群體內(nèi)核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)、核苷酸差異系數(shù)(K)。采用MEGA 5.0軟件計算COXⅠ和CYTB基因的堿基組成、變異位點數(shù)并構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)進化樹，Bootstrap 重復(fù)1 000 次檢驗置信度。采用TCS 1.21軟件制作單倍型網(wǎng)絡(luò)支系圖，以分析6個不同群體的親緣關(guān)系。采用分子方差分析法(AMOVA)分析香螺不同群體間的遺傳分化，并計算遺傳分化系數(shù)(Fst)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香螺COXⅠ和CYTB基因序列的堿基組成及變異分析

香螺線粒體COXⅠ和CYTB基因長度分別為1 536 bp和1 140 bp。變異位點中，兩基因均未發(fā)現(xiàn)插入/缺失位點。COXⅠ基因檢測到141個多態(tài)位點，11種單倍型，CYTB基因檢測到34個多態(tài)位點，14種單倍型；線粒體COXⅠ基因的T、C、A、G平均堿基含量分別為38.7%、16.2%、27.2%、18.0%，線粒體CYTB基因的T、C、A、G平均堿基含量分別為40.4%、17.0%、28.0%、14.6%(表1)。通過對6個不同群體間COXⅠ和CYTB堿基組成對比發(fā)現(xiàn)，兩基因的堿基組成較為接近，且A+T堿基含量均大于G+C。

表1 香螺COXⅠ和CYTB 基因序列的堿基組成

2.2 6個不同海域香螺COXⅠ和CYTB基因的單倍型分布

香螺線粒體COXⅠ基因的單倍型分布見表2，其中，WH群體獨有的單倍型是COXⅠ-03，YT群體獨有的單倍型是COXⅠ-5和COXⅠ-6，ZZ群體獨有的單倍型是COXⅠ-8和COXⅠ-9，DL群體獨有的單倍型是COXⅠ-10和COXⅠ-11。香螺線粒體CYTB基因單倍型分布見表3，其中，ZZ群體獨有的單倍型是CYTB-3、CYTB-5和CYTB-6，LS群體獨有的單倍型是CYTB-7、CYTB-8和CYTB-10，YT群體獨有的單倍型是CYTB-11和CYTB-14，WH群體獨有的單倍型是CYTB-12，PL群體獨有的單倍型是CYTB-13。

（2）首先檢查SDH電源是否故障，如果有即修復(fù)電源，修復(fù)后SDH若無告警則流程轉(zhuǎn)入第（4）步。若SDH告警為次要告警，則流程轉(zhuǎn)入第（3）步。若為主要告警，先對兩端SDH在ODF處自環(huán)，若告警不消除，則需要對ODF和SDH排查和檢修，ODF檢修為更換尾纖或光接頭，SDH檢修則為找出故障板卡并更換。若無主要告警，環(huán)回方式改成如下，在其中一端ODF處環(huán)回給對端，觀察對端是否有主要告警，若有告警即可診斷為光鏈路或中繼 SDH故障，需要參考專用保護通道故障定位處理方法解決故障，并消除中繼SDH故障。

表2 香螺各群體COXⅠ基因單倍型分布情況

表3 香螺各群體CYTB基因單倍型分布情況

2.3 香螺各群體內(nèi)COXⅠ和CYTB基因的遺傳多樣性分析

6個香螺群體內(nèi)COXⅠ和CYTB基因的遺傳參數(shù)如表4所示，COXⅠ及CYTB基因的平均核苷酸差異數(shù)K值變化范圍分別為0.000～31.133和1.222～13.444，COXⅠ基因K值變化范圍較大，且DL群體最高，為31.133，遠大于其他群體；核苷酸多樣性指數(shù)Pi分析顯示，COXⅠ基因中，DL群體的Pi值最高，為0.021 21，PL群體的Pi值最低，為0，而CYTB基因中，LS群體的Pi值最高，為0.012 36，PL群體的Pi值最低，為0.001 14。

表4 6個不同海域香螺COXⅠ和CYTB基因的群體遺傳多樣性參數(shù)

2.4 香螺各群體間COXⅠ和CYTB基因遺傳多樣性分析

6個群體間的遺傳參數(shù)如表5所示，香螺各群體間COXⅠ及CYTB基因K值變化幅度分別為24.971～2.094和11.497～1.395，COXⅠ基因K值變化幅度較大；COXⅠ基因中，YT和PL群體間的K值最低，DL與LS群體間的K值最高；在CYTB基因中，LS和其他群體間的核苷酸差異數(shù)與其他群體兩兩相比差異較大，表明LS群體是6個群體中差異較為明顯的群體。另外，在COXⅠ基因中，DL群體與ZZ、YT、WH群體間未發(fā)現(xiàn)共享的遺傳位點，PL群體與其他5個群體間也未發(fā)現(xiàn)共享的遺傳位點；但在CYTB基因中，DL群體與ZZ、YT、WH群體間有22個共享的遺傳位點，且PL群體與DL、ZZ、LS、YT及WH群體的共享遺傳位點數(shù)分別是22、44、46、26和44(表5)。

表5 6個不同海域香螺群體間的COXⅠ和CYTB基因平均核苷酸差異數(shù)K(對角線下)及共享變異位點(對角線上)

2.5 香螺COXⅠ和CYTB基因單倍型系統(tǒng)進化樹及網(wǎng)絡(luò)圖分析

使用MEGA5.0軟件制作單倍型系統(tǒng)進化樹,結(jié)果如圖1和圖2所示。在COXⅠ基因中，有3個分支的單倍型聚類，分別為具有最大優(yōu)勢分支的單倍型COXⅠ-06、COXⅠ-09、COXⅠ-02、COXⅠ-01、COXⅠ-11、COXⅠ-04、COXⅠ-05，單倍型COXⅠ-03、COXⅠ-07、COXⅠ-08為一個分支，僅單倍型COXⅠ-10單獨為一個分支(圖1)；CYTB基因中，有2個分支的單倍型聚類，一類為最大的優(yōu)勢分支單倍型CYTB-02、CYTB-04、CYTB-08、CYTB-06、CYTB-10、CYTB-09、CYTB-13、CYTB-05、CYTB-11、CYTB-14，另一類為單倍型CYTB-03、CYTB-12、CYTB-01、CYTB-07分支(圖2)。

圖1 COXⅠ基因單倍型系統(tǒng)進化樹

圖2 CYTB基因單倍型系統(tǒng)進化樹

使用TCS 1.21軟件制作單倍型網(wǎng)絡(luò)圖如圖3和圖4所示，其中，COXⅠ和CYTB基因在不同群體間單倍型交錯分布, 且未出現(xiàn)明顯地理差異。在COXⅠ基因中，最大的優(yōu)勢分支COXⅠ-02位于網(wǎng)絡(luò)圖的最中心；在CYTB基因中，兩分支中均有一個單倍型位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，分別是大分支的單倍型CYTB-02，小分支的單倍型CYTB-01。COXⅠ和CYTB基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖得到的結(jié)果與單倍型系統(tǒng)進化樹相似。

圖中每一個圓圈代表需要進行一次變異，下同。

圖4 CYTB基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 香螺各群體間的遺傳變異分析

從表6可見：COXⅠ和CYTB基因各群體間遺傳距離分別為0.002～0.018和0.001～0.005；COXⅠ基因中，DL群體與ZZ、LS、YT、WH、PL群體的遺傳距離分別為0.014、0.018、0.014、0.015、0.012，其他5個群體間的遺傳距離均小于0.012，其中ZZ、YT、PL群體之間的遺傳距離最小，分別為0.003、0.002、0.002；CYTB基因中，LS群體與其他5個群體間的遺傳距離均為0.005，而其他5個群體間的遺傳距離均小于0.005，YT、PL、ZZ群體間的遺傳距離最小，均為0.001。

表6 6個不同海域香螺群體間COXⅠ和CYTB的遺傳距離

從AMOVA分析結(jié)果中(表7)可知：COXⅠ和CYTB基因Fst指數(shù)分別為0.099 31和0.180 89，P值均大于0.05，說明群體間的遺傳分化并不明顯；另外，香螺6個群體內(nèi)COXⅠ和CYTB基因變異比例分別為90.07%和81.91%，群體間變異比例分別為9.93%和18.09%，說明群體內(nèi)有較為明顯的遺傳分化。

表7 基于6個不同海域香螺群體COXⅠ和CYTB基因序列的AMOVA分析

3 討論

3.1 香螺遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種生存發(fā)展的前提，也是其物種進化的潛力和適應(yīng)環(huán)境能力的基礎(chǔ)，更是物種多樣性的基礎(chǔ)[13]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是一個物種遺傳多樣性的衡量指標，因此，單倍型多樣性和核苷酸多樣性值越大，物種的遺傳多樣性越豐富，但當(dāng)研究數(shù)量較少時，核苷酸多樣性比單倍型多樣性更具有說服力[14-15]。根據(jù)Grant等[16]提出的標準，核苷酸多樣性指數(shù)以0.005為臨界線，高于0.005說明物種的遺傳多樣性較豐富。本研究中，COXⅠ和CYTB基因在WH群體中核苷酸多樣性指數(shù)為0.006 44和0.007 94，均大于0.005，推測可能是因為威海水資源的開發(fā)利用較小，遺傳多樣性較豐富。此外，還可能與其地理位置有關(guān)，威海緯度較低，這對氣溫和水溫有一定的影響，使其形成了一定的差異。

3.2 香螺單倍型分布及系統(tǒng)發(fā)育

本研究表明，在COXⅠ基因中，單倍型系統(tǒng)進化樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均有3個大分支，分析結(jié)果基本相同，不同群體在單倍型分布上并未出現(xiàn)明顯的地理差異，在群體中占比較大的單倍型是該群體中的優(yōu)勢單倍型，有1～2種。在CYTB基因中，單倍型系統(tǒng)進化樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均出現(xiàn)兩個分支，分析結(jié)果基本相同，且未發(fā)現(xiàn)明顯的地域差異，但ZZ、YT、WH、PL群體有獨有單倍型，說明交叉現(xiàn)象會在不同群體中出現(xiàn)。其中，最大優(yōu)勢分支單倍型COXⅠ-02和CYTB-02位于網(wǎng)絡(luò)圖最中心且占比最高，依據(jù)溯祖理論，祖先類型應(yīng)是占比最高的單倍型[17]，因此，推測中國黃、渤海海域的祖先類型可能為單倍型COXⅠ-02和CYTB-02。

3.3 香螺COXⅠ和CYTB基因的遺傳距離和遺傳分化

本研究表明，在COXⅠ基因中，從單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，各群體間產(chǎn)生了穿插滲透的現(xiàn)象，未出現(xiàn)明顯的群體差異，且單倍型和變異位點較豐富，說明群體間有較高的遺傳滲透率和遺傳相似度，這與趙丹等[18]對泥螺BullactaexarataCOXⅠ基因部分片段的研究結(jié)果相似。在CYTB基因中，LS群體的單倍型數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、平均核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、群體間遺傳參數(shù)和遺傳距離等指標均高于其他5個群體，說明LS群體與其他5個群體有較為明顯的差異，且遺傳背景及遺傳多樣性方面要優(yōu)于其他群體，說明物種對環(huán)境的適應(yīng)力與遺傳多樣性豐富度成正比[19-20]。Shaklee等[21]提出，魚類在種群的遺傳距離標準為0.05～0.30。依據(jù)此標準，本研究中6個不同海域群體香螺在COXⅠ基因中，DL群體和LS群體的遺傳距離最大，為0.018，小于種群的標準0.05；在CYTB基因中，群體間最大的遺傳距離為0.005，小于種群的標準。表明6個不同海域的香螺未達到亞種分化。

本研究中AMOVA分析顯示，香螺COXⅠ和CYTB基因群體內(nèi)變異都遠大于群體間差異，COXⅠ基因差異的主要原因是群體內(nèi)變異為群體，說明COXⅠ基因與其地理位置并未有明顯的相關(guān)性。王旭[22]通過COXⅠ和16S rRNA分析了黃口荔枝螺Thaisluteostoma和疣荔枝螺Reishiaclavigera的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，在整個遺傳變異中群體內(nèi)的遺傳變異最大，無明顯的地理結(jié)構(gòu)和譜系結(jié)構(gòu)，表明群體間不存在顯著的遺傳分化，本研究結(jié)果與之相似。COXⅠ基因中，從單倍型、變異位點數(shù)、遺傳距離等幾個指標中可以發(fā)現(xiàn)，DL群體均大于其他5個群體，說明在遺傳背景和遺傳多樣性方面DL群體與ZZ、LS、YT、WH、PL群體相比較為豐富。楊建敏等[23]通過對遼寧至山東的脈紅螺Rapanavenosa7個群體16S基因的遺傳多樣性進行研究，認為大連市大連灣群體是遺傳背景最為豐富的群體。本研究中CYTB基因差異的主要原因，推測認為是該基因片段未能出現(xiàn)明顯的地域差異。

3.4 香螺資源保護

香螺分布范圍和移動范圍較小，繁殖力較弱，由于捕撈強度變大，目前出現(xiàn)了顯著的資源衰竭[1]。因此，當(dāng)前要采取有效措施保護其資源。本研究中初步反映了香螺的遺傳背景，為制定相關(guān)的保護措施提供了依據(jù)。筆者認為，可通過多種方式對香螺的資源進行保護：1)保證香螺的餌料資源；2)嚴格限制捕撈的工具；3)從生產(chǎn)的實際情況考慮，嚴格控制捕撈期。然而，若從遺傳多樣性角度分析香螺的資源，還需通過其他技術(shù)獲取相關(guān)的分子數(shù)據(jù)庫。

4 結(jié)論

1)中國不同海域間香螺遺傳多樣性較為豐富，威海群體COXⅠ和CYTB基因的核苷酸多樣性指數(shù)較高，均大于0.005。

2)不同海域間香螺具有群體獨有的單倍型，可作為鑒別不同地理種群的重要依據(jù)。

3)不同海域間香螺未出現(xiàn)明顯的群體間差異，但群體內(nèi)變異遠大于群體間差異，不同海域間香螺未達到亞種分化水平。