王邢艷，徐東坡,張婉平，童奇烈，方弟安，周彥鋒，張敏瑩*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，江蘇 無錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學 漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081；3.杭州市漁政漁港漁船監(jiān)督管理總站，浙江 杭州 310008)

三角魴Megalobramaterminalis，因背鰭高、頭尖尾長，從側(cè)面觀察形似三角形而得名，為魴屬鯉形目，主要分布在中國長江水系、黃河水系、黑龍江水系等淡水區(qū)域[1-2]，其體大肉厚，肉質(zhì)嫩滑，深受消費者的喜愛，是中國重要的經(jīng)濟魚類之一。歷史上，錢塘江漁業(yè)資源豐富，除盛產(chǎn)富春江鰣魚Tenualosareevesii、花鱸Lateolabraxjaponicus和子陵魚Rhinogobiusgiurinus等多個種[3]外，三角魴的野生資源也很豐富[4]。近年來，錢塘江漁業(yè)資源衰退，三角魴野生資源也日益衰退[5]。和其他魚類一樣，為了修復、補充野生資源，三角魴也進行了大規(guī)模的增殖放流。據(jù)杭州市漁政漁港監(jiān)督管理總站不完全統(tǒng)計，僅2018年錢塘江中下游就放流了三角魴冬片5.4萬kg。

目前，有關(guān)三角魴的研究較多，早期主要集中在種群形態(tài)差異[6]、分類整理[7]、染色體核型與DNA含量[8]、胚胎發(fā)育[9]和腦垂體超微結(jié)構(gòu)[10]等方面，近年來出現(xiàn)了一些有關(guān)線粒體基因組方面的研究報道。謝楠等[11]利用細胞色素b基因(cytb)研究了魴屬種間的分類情況；賴瑞芳等[12]和Hu等[13]對魴屬魚類線粒體基因序列及種間親緣關(guān)系進行了研究；另外，也有少量關(guān)于轉(zhuǎn)錄組的研究報道[14]。但有關(guān)三角魴放流苗種的種質(zhì)質(zhì)量、放流群體的遺傳多樣性及遺傳分化等研究尚未見報道。

種質(zhì)是生物體親代傳遞給子代的遺傳物質(zhì)，而遺傳多樣性是衡量種質(zhì)優(yōu)劣的重要指標。廣義的遺傳多樣性是指生物種內(nèi)和種間的遺傳差異度[15]，遺傳多樣性越高，物種或種群對環(huán)境的適應(yīng)力越強。細胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)基因是線粒體基因的重要組成部分，具有結(jié)構(gòu)簡單、進化速率適中、多態(tài)性較高及易被通用引物擴增等特點。作為一種DNA條形碼，COⅠ基因被廣泛應(yīng)用于不同生物類群的種類鑒定中[16-17]，也被用于種群的遺傳多樣性分析[18-19]和系統(tǒng)進化分析中[20]。本研究中，以親本群體、放流群體和錢塘江自然捕撈群體為研究對象，測定了錢塘江三角魴6個群體的COⅠ基因序列，并對其進行遺傳多樣性和群體遺傳分化研究，以期為評估放流苗種種質(zhì)質(zhì)量和指導其科學增殖放流提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

試驗群體為2個良種場親本群體、3個放流群體和1個錢塘江自然捕撈群體，其中景山親本群體(JS)和柏松親本群體(BS)采集于各良種場,采集對象是當年參與繁殖的親本；余杭(YH)、桐廬(TL)和建德(JD)放流群體采集于放流現(xiàn)場,采集對象是放流冬片魚的苗種(體質(zhì)量約20 g)，利用漁業(yè)資源監(jiān)測網(wǎng)點，在錢塘江中下游的桐廬、新桐鄉(xiāng)、富陽、一橋和六橋5個捕撈位點采集自然捕撈群體(BL)親本群體，盡量采集所有參加繁殖的個體，放流群體隨機采集。所有樣本取樣部位均為尾鰭，所有樣本保存于分析純乙醇中，帶回實驗室備用。樣本采集時間、采樣信息見表1和圖1。

表1 三角魴樣品采集信息

1.2 DNA提取與PCR擴增測序

隨機取各群體樣品，采用試劑盒法(TIANamp Marine Animals DNA Kit)進行DNA抽提，用8 g/L瓊脂糖凝膠(Nared染色)電泳檢測DNA提取效果，將檢測合格的DNA放入-20 ℃冰箱保存，用于PCR反應(yīng)。

PCR擴增引物設(shè)計參照文獻[21],其序列Fish F1：5′TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3′；Fish R1：5′TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3′。引物由生工生物(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(共10 μL)：Premix Taq 5 μL，雙蒸水3.5 μL，正、反向引物各0.25 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，50 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸40 s，共進行30個循環(huán)；最后再在72 ℃下延伸8 min，4 ℃條件下保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗，用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene)觀察目的條帶的擴增效果。

將擴增效果好的產(chǎn)物送生工生物(上海)有限公司進行純化、測序，測序引物與擴增引物相同。共成功測序224尾三角魴樣品，其中，景山親本群體(JS)45尾，柏松親本群體(BS)46尾，自然捕撈群體(BL)40尾，建德放流群體(JD)31尾，桐廬放流群體(TL)30尾，余杭放流群體(YH)32尾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測定的序列運用ClustalX 1.81軟件進行對位排列并人工校對，將對齊后的序列導入MEGA 3.1軟件進行計算，得到堿基組成(nucleotide composition)、變異位點(variable sites)、簡約信息位點(parsim-info sites)[22]。將得到的Meg文件導入DNASP 5.10軟件包進行計算，得到群體的單倍型數(shù)(number of haplotypes)、單倍型多樣性(haplotypes diversity,Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(nucleotide differences,K)[23]，其中K代表每個群體內(nèi)兩個隨機選取的mtDNA序列間平均每個位點的核苷酸數(shù)目[24]。利用Arlequin 3.11軟件中的分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA)估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布及地理群體分化水平(F-statistics,Fst)[25]，運用Nm=(1-Fst)/(4Fst)公式計算基因流(Nm)。利用 Network 4.6 軟件構(gòu)建單倍型的簡約中介(reduced-median, medium-join(MJ))網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列多樣性和單倍型分析

三角魴樣本經(jīng)PCR擴增、電泳后得到清晰的COⅠ基因條帶，長度約為700 bp(圖2)。

M—DNA maker；1～7—景山三角魴樣本。

利用 ClustalX 軟件對測序所獲目的片段進行手工校對，獲得長度為 661 bp 的同源序列, 經(jīng)Blast同源性分析，與三角魴線粒體DNA 全序列(GenBank:MN604 232.1)中COⅠ序列的一致性高達99.97%，確認所測序列為三角魴COⅠ序列。在661 個位點中，共檢測到 192個變異位點，占總位點數(shù)的29.05%，其中，簡約信息位點 51個，單堿基變異位點 141 個。COⅠ 序列中堿基A、T、C、G 的平均含量分別為26.5%(25.8%～27.2%)、28.0%(27.0%～29.0%)、29.0%(28.1%～29.9%)和16.5%(15.4%～17.9%)，其中，C 堿基含量最高，G 堿基含量最低，且 A+T 的含量(54.5%)高于 C+G 的含量(45.5%)，具有一定的A.T 偏好性和C堿基偏好，表現(xiàn)出了堿基組成的偏向性，與賴瑞芳等[12]對魴屬種群研究結(jié)果相同。

224尾三角魴樣本共檢出31種單倍型(表2)，其中，6種為共享單倍型，25種為單個群體的特有單倍型。hap9是6個群體的共享單倍型，為第一優(yōu)勢單倍型，占樣本總數(shù)的48.66%；hap2為5個群體的共享單倍型，占樣本總數(shù)的22.32%；hap4和hap5為3個群體的共享單倍型，分別占樣本總數(shù)的9.38%和4.46%；hap10和hap21為2個群體的共享單倍型，均占樣本總數(shù)的0.89%。

表2 三角魴6個群體線粒體COⅠ基因單倍型分布

僅單個群體特有的單倍型占樣本總數(shù) 13.4%，柏松放流群體有6種特有單倍型，桐廬放流群體和自然捕撈群體各有5種特有單倍型；景山親本群體、建德放流群體和余杭放流群體的特有單倍型數(shù)依次為4、3、2種。

2.2 群體遺傳多樣性及中性檢驗

遺傳多樣性是指生物群體間，以及群體內(nèi)在分子、細胞和個體3個方面的遺傳變異度。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)常用來度量遺傳多樣性，Hd和Pi值越高，群體的多態(tài)程度越高，遺傳多樣性越豐富。本研究中，三角魴6個群體遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計及中性檢驗(Tajima’sD檢驗)結(jié)果表明：6個群體的Hd為0.710～0.848(平均值為0.705)，說明6個群體的單倍型多樣性均較高;6個群體的Pi為0.003 07～0.008 40(平均值為0.005 78)；6個群體的平均核苷酸差異數(shù)K

由高到低依次為景山親本群體、桐廬放流群體、自然捕撈群體、建德放流群體、柏松親本群體和余杭放流群體(表3)。這表明，6個群體整體遺傳多樣性水平較高，景山親本群體的遺傳多樣性最高，余杭放流群體的遺傳多樣性最低。

中性檢驗表明，6個群體的Tajima’sD值為-2.658 38～-1.024 81，4個群體不同程度地顯著偏離中性假說(P<0.05),柏松群體和余杭群體遵循中性假說。將所有樣本作為一個整體進行分析，Tajima’sD值為負值偏離中性進化(表3)，由此推測，6個三角魴群體可能在進化過程中存在種群擴張事件。

表3 三角魴6個群體的遺傳多樣性參數(shù)及Tajima’s D檢驗

2.3 群體遺傳分化及分子方差分析

采用雙參數(shù)法(K2P)得到基于Nei’s的遺傳距離，結(jié)果表明，不同群體間遺傳距離為0.003～0.009，其中，建德放流群體和柏松親本群體間的遺傳距離最小(0.003)，景山親本群體與桐廬放流群體、捕撈群體間的遺傳距離最大(均為0.009)(表4)。

表4 三角魴群體間的K2P遺傳距離

基于COⅠ基因的6個群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)為-0.009 34～0.193 55，大多在0.05～0.15，表明大部分群體間為中度遺傳分化，且達到顯著性水平(P<0.05)；桐廬放流群體與柏松親本群體間、桐廬放流群體與景山親本群體間及柏松親本群體與捕撈群體間的遺傳分化系數(shù)均大于0.15，群體間為高度遺傳分化，且達到極顯著性水平(P<0.01)；建德放流群體與余杭放流群體，柏松親本群體與景山親本群體，余杭群體、桐廬群體、建德群體與捕撈群體間的遺傳分化系數(shù)均小于0.05，群體間為輕微的遺傳分化，且未達到顯著性水平(P>0.05)。從遺傳分化指數(shù)看，大部分群體間具有一定程度遺傳分化，但是群體間的基因流Nm大于1，部分群體間的基因流大于4(表5)，說明群體間基因交流較頻繁，制約種群間的遺傳分化。

表5 基于 COⅠ 基因序列的三角魴群體間遺傳分化指數(shù)Fst(右上角)和基因流Nm(左下角)分析

將6個三角魴群體不分組進行AMOVA分析，結(jié)果顯示，群體間的遺傳變異為9.91%，群體內(nèi)的遺傳變異為90.09%，遺傳變異主要來自群體內(nèi)；群體間遺傳分化指數(shù)平均值為0.099 09，存在一定程度的遺傳分化(P<0.01)(表6)。

將6個三角魴群體分為兩個組進行AMOVA分析，分為自然捕撈群體和養(yǎng)殖群體(包括2個親本群體和3個放流群體)，結(jié)果顯示,組間遺傳變異為-0.59%，組內(nèi)群體間遺傳變異為10.16%，群體內(nèi)變異為90.44%，遺傳變異主要來自群體內(nèi)；組間遺傳分化系數(shù)為-0.005 94，且未達到顯著水平(P>0.05)，這說明自然捕撈群體和養(yǎng)殖群體間不存在顯著的遺傳分化；群體間遺傳分化指數(shù)平均值為0.095 64，存在一定程度的遺傳分化(表6)，這一結(jié)果與未分組的分析結(jié)果一致。

表6 三角魴6個群體mtDNA COⅠ基因序列的分子方差分析(AMOVA)

2.4 群體間系統(tǒng)進化分析

基于群體間Nei’s遺傳距離(表4)，采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示,建德放流群體和柏松親本群體最先聚為一支，然后依次與余杭放流群體、桐廬放流群體、自然捕撈群體聚在一起，最后與景山群體聚在一起(圖3)。這表明，建德放流群體與柏松親本群體親緣關(guān)系最近，與景山親本群體親緣關(guān)系最遠。

圖3 基于遺傳距離的三角魴6個群體系統(tǒng)進化樹

單倍型MJ網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)顯示，hap9為第一優(yōu)勢單倍型，出現(xiàn)頻率最高且位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，其他單倍型都是hap9經(jīng)過一步或幾步突變形成的，由此可以推測，hap9可能為最原始單倍型。每個群體都存在其特有的單倍型，也存在群體共享的單倍型，整體上并不存在明顯的遺傳分化。

圖4 三角魴mtDNA COⅠ區(qū)31個單倍型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

3 討論

3.1 三角魴6個群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分之一，是物種穩(wěn)定和進化的基礎(chǔ)。一個物種的遺傳多樣性或變異度越豐富，適應(yīng)環(huán)境的能力就越強，具有的進化潛力就會越大[26]。本研究中，6個群體共檢測到31個單倍型，單倍型種類較為豐富，且每個群體都含有其特有單倍型。其中，hap9是6個群體都含有的共享單倍型，這說明hap9單倍型有可能是十分穩(wěn)定的，屬于能夠適應(yīng)環(huán)境變化的原始單倍型，這與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示的以hap9為網(wǎng)絡(luò)中心的結(jié)果一致。遺傳多樣性判斷的重要指標為單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)。梁宏偉等[27]和潘賢輝等[28]均是利用單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)判斷群體遺傳多樣性的高低。Grant等[29]對海洋魚類線粒體基因的研究表明，Hd>0.5，Pi>0.005時，說明單倍型多樣性和核苷酸多樣性高，這兩個數(shù)值越大則表明遺傳多樣性越高。本研究中，6個三角魴群體的Hd值范圍為0.710～0.848(平均值為0.705)，Pi值范圍為0.003 07～0.008 40(平均值為0.005 78)，因此，三角魴6個群體作為一個種群來說，遺傳多樣性較高。其中，景山親本群體、自然捕撈群體、桐廬放流群體的Hd值依次為0.779、0.710、0.848，Pi值依次為0.008 40、0.007 84、0.008 18，單倍型多樣性均大于0.5且核苷酸多樣性大于0.005，單倍型多樣性和核酸多樣性均較高，說明這3個群體的遺傳多樣性均較高。聶竹蘭[14]指出，錢塘江野生三角魴的遺傳多樣性較高，與本研究中自然捕撈群體的遺傳多樣性研究結(jié)果一致。本研究中建德放流群體、柏松親本群體、余杭放流群體單倍型多樣性較高(Hd>0.5)，但核苷酸多樣性較低(Pi<0.005)，說明這3個群體的遺傳多樣性相對較低。

3.2 三角魴群體的Tajima’s D檢驗及遺傳分化

Tajima’sD值大于0代表群體觀測雜合度高于預(yù)期雜合度，稀有等位基因頻率降低(群體收縮或者平衡選擇)，小于0說明群體觀測雜合位點少于預(yù)期值，稀有等位基因頻率增加(群體擴張或者低頻選擇)[30]。本研究中，6個群體的D值為-2.658 38～-1.024 81，其中，3個群體的D值顯著或極顯著偏離0，6個群體作為一個總體時中性檢驗結(jié)果D值為-2.790 60，極顯著偏離中性假說(P<0.001)，這說明6個三角魴群體內(nèi)低頻率基因(稀有基因)出現(xiàn)頻率增大，群體在某種程度上經(jīng)歷了定向選擇或群體個體數(shù)量的快速增長[31]，這與本研究中三角魴群體表現(xiàn)出的高單倍型多樣性值和低核苷酸多樣性值現(xiàn)象是吻合的，因為有研究表明，從一個較小的有效群體快速擴張而成的群體，極有可能積累了足夠的單倍型多樣性，并未積累足夠的核苷酸序列多樣性[32]。

本研究中，依據(jù)遺傳距離可知，群體間遺傳距離未達到亞種的分化水平[33]。本研究中基因流結(jié)果顯示，大部分群體間的基因流Nm>1，其中，部分群體間的基因流Nm>4，顯示6個群體間有著頻繁的基因交流。近些年，在錢塘江中對三角魴進行了大規(guī)模的增殖放流，兩個親本良種場群體(景山群體、柏松群體)提供三角魴子代以供放流，3個放流群體(桐廬、余杭、建德群體)提供三角魴冬片以供放流，因此，這5個養(yǎng)殖群體的三角魴已經(jīng)與錢塘江野生三角魴頻繁進行了基因交流，降低了這5個群體與天然捕撈群體間的遺傳分化，這與分組AMOVA分析得出的養(yǎng)殖群體與天然捕撈群體間不存在顯著的遺傳分化結(jié)果是一致的(Fct=-0.005 94，P>0.05)。

本研究中，根據(jù)不分組群體間遺傳分化指數(shù)為0.099 09可知，整體上群體間處于中等遺傳分化水平,但并非所有群體間都為中等遺傳分化[34]，桐廬、余杭、建德3個放流群體與自然捕撈群體間遺傳分化系數(shù)Fst<0.05，屬輕度遺傳分化，說明放流苗種遺傳多樣性與自然捕撈群體無顯著性差異；而景山親本群體、柏松親本群體與自然捕撈群體間遺傳分化程度相對較大(Fst為0.135 23和0.173 66)，可能是放流群體直接與自然捕撈群體有基因交流，而親本群體是通過繁育的子一代經(jīng)過人工選擇之后，再與自然捕撈群體進行基因交流。

3.3 三角魴放流苗種的種質(zhì)質(zhì)量

本研究中，從單倍型多樣性值和核苷酸多樣性值來看，自然捕撈群體的遺傳多樣性低于景山群體和桐廬群體，高于余杭群體、柏松群體和建德群體。景山群體、桐廬群體與捕撈群體處于相近的遺傳多樣性水平，可認為不會對自然群體造成遺傳學影響。捕撈群體的單倍型指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均較高，三角魴群體遺傳多樣性較為豐富，自然資源狀況較好。分組AMOVA分析得出養(yǎng)殖群體(包括2個親本群體和3個放流群體)與天然捕撈群體間不存在顯著的遺傳分化(表6，F(xiàn)ct=-0.005 94)，說明放流的三角魴群體進入錢塘江之后，可以較好地融入天然群體，進而補充錢塘江三角魴資源量。增殖放流存在降低自然群體遺傳多樣性水平的可能性，因此，在增殖放流過程中選取良好的苗種是十分重要的。種質(zhì)良好的苗種能保證放流群體和野生群體的遺傳多樣性處于同一水平，達到既補充自然資源又不改變自然資源的遺傳結(jié)構(gòu)的目的。

4 結(jié)論

1)兩個親本群體(景山和柏松群體)、3個放流群體(余杭、桐廬和建德群體)和捕撈群體遺傳分化處于中等水平，基因交流較多。

2)自然捕撈群體的遺傳多樣性較高，錢塘江三角魴種質(zhì)資源較好。

3)自然捕撈群體與養(yǎng)殖群體間不存在顯著的遺傳分化，2個親本群體和3個放流群體可作為良 好的增殖放流備選親本群體和苗種群體。