梁簫，丁文揚(yáng)，張馳，蔡雨珊，楊金龍,3*

(1.上海海洋大學(xué) 國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)，廣東 廣州 511458)

厚殼貽貝Mytiluscoruscus隸屬于貽貝科Mytilidae，是中國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)之一，廣泛分布于中國(guó)的渤海、黃海、東海等海區(qū)[1-3]。厚殼貽貝也是一種典型的大型污損生物，常出現(xiàn)在船舶的底部、橋墩及其他水下設(shè)施上，對(duì)其進(jìn)行腐蝕, 從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。厚殼貽貝在其生活史中會(huì)經(jīng)歷由浮游生活向底棲生活轉(zhuǎn)變的過(guò)程，這一過(guò)程被稱(chēng)為附著變態(tài)[5]。附著變態(tài)的成功與否不僅關(guān)系到厚殼貽貝的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)對(duì)于海洋大型污損生物的防治也具有重要意義。

在海洋環(huán)境中，細(xì)菌主要以生物被膜形式存在，且這種存在形式對(duì)厚殼貽貝等大型污損生物的附著變態(tài)有一定的影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)，自然生物被膜的細(xì)菌密度與地中海貽貝、鹿角杯形珊瑚的附著變態(tài)率呈正相關(guān)[7-9]；單一海洋細(xì)菌形成的生物被膜的細(xì)菌密度和厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)間存在非常明顯的關(guān)聯(lián)性[10]。通過(guò)影響生物被膜的形成，如降低其細(xì)菌密度等生物學(xué)特性的方法可能對(duì)抑制厚殼貽貝等大型污損生物的附著變態(tài)具有一定的作用。影響生物被膜形成的因素較多，其中，脂肪酸作為一種天然分子具有抑制微生物被膜形成的巨大潛力[11]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜的脂肪酸組成會(huì)影響其生物的物理性質(zhì)(即流動(dòng)性和柔韌性)，通過(guò)影響細(xì)胞黏附改變細(xì)胞膜流動(dòng)性及調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)從而抑制生物被膜的發(fā)育[12-13]?？梢?jiàn)，可以考慮使用脂肪酸抑制細(xì)菌生物被膜的形成，從而降低其細(xì)菌密度的方式來(lái)控制厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)率，達(dá)到防治大型海洋生物污損的效果。

本研究中，選取海假交替單胞菌Pseudoalteromonasmarina[14]為研究對(duì)象，選取3種效果較為有效的脂肪酸,通過(guò)3種脂肪酸與海假交替單胞菌形成的生物被膜的特征變化，探究脂肪酸對(duì)海假交替單胞菌生物被膜的細(xì)菌密度、膜厚、胞外物質(zhì)等生物學(xué)特性的影響，從而解釋脂肪酸、細(xì)菌生物被膜及厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)三者間的關(guān)系，旨在為大型海洋污損生物的防治工作及厚殼貽貝的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用厚殼貽貝幼蟲(chóng)取自浙江省舟山市嵊泗縣(N 30°69′、E 122°46′)，幼蟲(chóng)在實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行試驗(yàn)。暫養(yǎng)條件為18 ℃充氣培養(yǎng)，每天換水投喂餌料。

試驗(yàn)用細(xì)菌海假交替單胞菌[14]分離自自然微生物被膜(保藏號(hào)MCCC 1K03544)，保存于-80 ℃冰箱中。棕櫚酸(十六烷酸，Palmitic acid)、硬脂酸(十八烷酸，Stearic acid)、油酸(十八烯酸，Oleic acid)(Anpel,中國(guó))使用二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,美國(guó))助溶于滅菌過(guò)濾海水。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜的制備 參考Yang等[10]的方法，將海假交替單胞菌在2216E固體培養(yǎng)基上劃線，挑選單菌落使用2216E液體培養(yǎng)基在25 ℃下以200 r/min培養(yǎng)24 h。將擴(kuò)配后的細(xì)菌收集在離心管中，以3 500 r/min離心15 min，棄上清，留沉淀。加入滅菌過(guò)濾海水吹打混勻，以3 500 r/min離心15 min，棄上清，留沉淀，重復(fù)上述步驟3次。最終將沉淀使用滅菌過(guò)濾海水定容至50 mL,充分混勻至細(xì)菌懸濁液。取100 μL細(xì)菌懸濁液加入9 900 μL滅菌過(guò)濾海水稀釋?zhuān)浞只靹蚝笕? mL使用0.22 μm濾膜(Whatman)過(guò)濾，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1%的吖啶橙染色5 min，待染色液風(fēng)干后使用熒光顯微鏡(Olympus BX51)在1 000倍下隨機(jī)選10 個(gè)顯微鏡視野進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，最終通過(guò)計(jì)算確定細(xì)菌密度。根據(jù)所得細(xì)菌密度向裝有無(wú)菌載玻片(12.7 mm×38.1 mm)的無(wú)菌培養(yǎng)皿(64 mm×19 mm)中加入相應(yīng)量菌液，并使用滅菌過(guò)濾海水定容至20 mL，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 海假交替單胞菌與脂肪酸共同形成生物被膜 將滅菌處理后的載玻片置入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，根據(jù)細(xì)菌密度分別加入相應(yīng)細(xì)菌菌液和棕櫚酸、硬脂酸、油酸及混合脂肪酸(質(zhì)量比1∶1∶1)，使用滅菌過(guò)濾海水定容至20 mL，最終使得細(xì)菌菌液濃度為5×108cells/mL，脂肪酸質(zhì)量濃度為0、0.01、0.1、1、5 μg/mL，同時(shí)設(shè)置DMSO、腎上腺素(EPI)和空白組，每個(gè)組設(shè)9個(gè)平行，各組細(xì)菌于18 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)48 h，最終形成生物被膜。

1.2.3 生物被膜細(xì)菌密度計(jì)數(shù) 參考Yang等[10]方法，采用體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林將培養(yǎng)好的生物被膜進(jìn)行固定，然后采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吖啶橙溶液對(duì)生物被膜染色5 min，待染色液風(fēng)干后使用鏡油制片，然后通過(guò)熒光顯微鏡(Olympus BX51)在1 000倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)細(xì)菌視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.4 幼蟲(chóng)附著試驗(yàn) 取出培養(yǎng)好的細(xì)菌生物被膜，使用滅菌過(guò)濾海水輕輕涮洗，洗去表面浮游細(xì)菌。然后將生物被膜載玻片放入盛有20 mL滅菌過(guò)濾海水的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使用解剖鏡向培養(yǎng)皿中分別加入20只厚殼貽貝的眼點(diǎn)幼蟲(chóng)，于18 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，并分別統(tǒng)計(jì)12、24、48、96 h后的變態(tài)個(gè)體，并除以樣本基數(shù)，計(jì)算出變態(tài)率。

1.2.6 生物被膜激光共聚焦 染色后的生物被膜采用共聚焦顯微鏡(徠卡TCS SP8)與LAS X軟件進(jìn)行共聚焦拍攝。共聚焦顯微鏡及軟件設(shè)置為物鏡63倍，z-step 0.2 μm，像素1 024×1 024。每片生物被膜隨機(jī)選取3個(gè)顯微鏡視野拍攝，每組設(shè)置3個(gè)平行進(jìn)行拍攝分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用JMP 10.0.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢驗(yàn)。附著變態(tài)率與細(xì)菌密度、膜厚、胞外產(chǎn)物生物量的相關(guān)性檢驗(yàn)采用多元分析方法，顯著性水平設(shè)為0.05。用Image J軟件處理共聚焦顯微鏡拍攝圖像，計(jì)算生物被膜胞外產(chǎn)物共聚焦體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的影響

從圖1可知，加入不同種類(lèi)及質(zhì)量濃度的脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜會(huì)對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)有不同的誘導(dǎo)活性。當(dāng)單獨(dú)加入一種脂肪酸時(shí)，與海假交替單胞菌單獨(dú)形成的生物被膜的幼蟲(chóng)附著變態(tài)率相比棕櫚酸和硬脂酸分別只在質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，幼蟲(chóng)附著變態(tài)率顯著上升(P<0.05)，而油酸在4個(gè)濃度下的幼蟲(chóng)附著變態(tài)率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。相比而言，混合脂肪酸(質(zhì)量比1∶1∶1)則顯示出了不同的結(jié)果，隨著混合脂肪酸質(zhì)量濃度的增加，其共同形成的生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)率逐漸升高；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時(shí)，其所共同形成的生物被膜的附著變態(tài)率(32.8%)，相比海假交替單胞菌單獨(dú)形成的生物被膜的幼蟲(chóng)附著變態(tài)率(30.5%)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，其所共同形成的生物被膜的附著變態(tài)率(40.5%)達(dá)到最高，相比海假交替單胞菌單獨(dú)形成的生物被膜的幼蟲(chóng)附著變態(tài)率顯著性升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 混合脂肪酸對(duì)生物被膜細(xì)菌密度的影響

從圖2可見(jiàn)：所有組海假交替單胞菌初始細(xì)菌密度均為5×108cells/mL，不同質(zhì)量濃度的混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜細(xì)菌密度會(huì)產(chǎn)生不同結(jié)果；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時(shí)，共同形成的生物被膜細(xì)菌密度(1.79×107cells/cm2)與單一細(xì)菌(脂肪酸質(zhì)量濃度為0 mg/L)形成的生物被膜細(xì)菌密度(1.78×107cells/cm2)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，共同形成的生物被膜細(xì)菌密度(1.70×107cells/cm2)相比單一細(xì)菌顯著降低(P<0.05)；隨著混合脂肪酸質(zhì)量濃度的升高，生物被膜細(xì)菌密度隨之降低，混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，共同形成的生物被膜細(xì)菌密度(1.40×107cells/cm2)達(dá)到最低(P<0.05)。

2.3 混合脂肪酸對(duì)生物被膜形態(tài)與厚度的影響

從圖3可見(jiàn)：所有組海假交替單胞菌初始細(xì)菌密度均為5×108cells/mL，不同質(zhì)量濃度的混合脂肪酸會(huì)影響其與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜細(xì)菌分布及生物被膜膜厚；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時(shí)，共同形成的生物被膜膜厚(4.82 μm)與單一細(xì)菌(脂肪酸質(zhì)量濃度為0 mg/L)形成的生物被膜膜厚(4.89 μm)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，共同形成的生物被膜膜厚(4.51 μm)相比單一細(xì)菌形成的生物被膜膜厚顯著降低(P<0.05)；隨著混合脂肪酸質(zhì)量濃度的增加，共同形成的生物被膜的膜厚隨之降低，當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，其與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜的膜厚(3.44 μm)達(dá)到最低，且具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 共聚焦顯微鏡下不同質(zhì)量濃度混合脂肪酸的生物被膜形態(tài)與膜厚

2.4 混合脂肪酸對(duì)生物被膜胞外多糖的影響

選取5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜，觀察其對(duì)生物被膜胞外多糖的影響。從圖4可見(jiàn)，5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜的α多糖、β多糖的生物量均與單一細(xì)菌形成的生物被膜無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖4 共同形成的生物被膜胞外α多糖和β多糖的共聚焦顯微鏡圖像和生物量

2.5 混合脂肪酸對(duì)生物被膜胞外蛋白質(zhì)的影響

選取5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜，觀察其對(duì)生物被膜胞外蛋白質(zhì)的影響。從圖5(a)、(b)可知，5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜胞外蛋白質(zhì)與海假交替單胞菌單獨(dú)形成的生物被膜胞外蛋白質(zhì)相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.6 混合脂肪酸對(duì)生物被膜胞外脂類(lèi)的影響

選取5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜，觀察其對(duì)生物被膜胞外多糖的影響。由圖5(c)、(d)可知，5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜胞外脂類(lèi)(生物量體積為150 μm3)與海假交替單胞菌單獨(dú)形成的生物被膜胞外脂類(lèi)相比(生物量體積為89.60 μm3)有顯著升高(P<0.05)。

圖5 共同形成的生物被膜胞外蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的共聚焦顯微鏡圖像和生物量

3 討論

脂肪酸是一種天然分子，廣泛分布于所有生命形式中[11]。脂肪酸能夠影響生物被膜的形成，如某些脂肪酸可以選擇性地抑制或破壞金黃色葡萄球菌[16-17]、銅綠假單胞菌[18-19]、白色念珠菌[20-21]、黏質(zhì)沙雷氏菌、伯克霍爾德菌及弧菌等[22-24]生物被膜的形成。同時(shí)生物被膜會(huì)誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)[3,10]。然而脂肪酸是否可以通過(guò)影響細(xì)菌生物被膜的形成抑制厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)尚未有試驗(yàn)驗(yàn)證。因此，本研究中使用不同質(zhì)量濃度的棕櫚酸、硬脂酸、油酸及3種脂肪酸的混合物與海假交替單胞菌共同培養(yǎng)生物被膜，并對(duì)所形成生物被膜的密度、膜厚、胞外產(chǎn)物，以及對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的誘導(dǎo)活性進(jìn)行了研究。

3.1 3種脂肪酸對(duì)生物被膜形成的影響

本試驗(yàn)中，不同質(zhì)量濃度脂肪酸對(duì)生物被膜形成有不同的影響，當(dāng)3種混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，生物被膜的細(xì)菌密度和膜厚達(dá)到最低值。同時(shí)，通過(guò)共聚焦圖像可以看出，其相比海假交替單胞菌單獨(dú)形成的生物被膜細(xì)菌數(shù)量更少且更加分散。有研究表明，棕櫚酸質(zhì)量濃度為12.8 mg/L時(shí)，將會(huì)抑制Pseudomonasaeruginosa生物被膜的形成[18]；外源添加油酸抑制了金黃色葡萄球菌的黏附和生物被膜的形成[25-26]；此外，含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的牛肉正己烷提取物及其合成混合物對(duì)大腸桿菌生物被膜的形成具有抑制作用[27]。這些結(jié)果均與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，表明脂肪酸可以抑制細(xì)菌生物被膜的形成。

3.2 脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的影響

被脂肪酸所影響的生物被膜是否也能導(dǎo)致厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)率的下降,本試驗(yàn)中幼蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)脂肪酸處理后密度和厚度下降的生物被膜反而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)，這與最初試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)所預(yù)想的結(jié)果完全相反。這表明，影響厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的因素除了生物被膜的細(xì)菌密度及膜厚之外，還存在其他影響因素。生物被膜作為細(xì)菌的一種主要存在形式，可以誘導(dǎo)厚殼貽貝等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的附著變態(tài)[6-10]。生物被膜的組成成分較為復(fù)雜，主要包含細(xì)菌及胞外產(chǎn)物兩大部分。生物被膜的細(xì)菌密度、膜厚等生物學(xué)特征是影響海洋無(wú)脊椎動(dòng)物附著變態(tài)的重要誘因[7-9]。此外，本試驗(yàn)中還對(duì)混合脂肪酸處理后的海假交替單胞菌生物被膜的細(xì)菌密度與厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)率進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物被膜的細(xì)菌密度與幼蟲(chóng)附著變態(tài)率無(wú)顯著相關(guān)性(P<0.05)。

生物被膜的胞外產(chǎn)物主要包含多糖、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等[28]。對(duì)Pseudoalteromonaslipolytica的研究發(fā)現(xiàn)，AT00_08765基因的敲除導(dǎo)致纖維素的過(guò)量產(chǎn)生，從而抑制厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著[29]。海假交替單胞菌中01912基因的缺失導(dǎo)致可拉酸含量增加，從而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)[30]。海假交替單胞菌中鞭毛蛋白可以促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)[31]。對(duì)Pseudoalteromonasatlantica和Shewanellaloihica生物被膜與厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，其附著變態(tài)率的下降可能是由于生物被膜胞外多糖或胞外脂含量的減少所導(dǎo)致[32]。這些研究結(jié)果均表明，厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)除與生物被膜細(xì)菌密度有關(guān)外，還可能與生物被膜胞外產(chǎn)物有關(guān)。因此，本研究中通過(guò)共聚焦染色分析法，對(duì)3種脂肪酸混合物質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)(厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)率最高)所形成的生物被膜的胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)、胞外脂類(lèi)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)含量無(wú)明顯變化，而生物被膜胞外脂含量顯著升高。通過(guò)以上結(jié)果推測(cè)，幼蟲(chóng)附著變態(tài)率的上升可能與生物被膜胞外脂含量的升高有關(guān)。但生物被膜胞外脂含量的升高是由于脂肪酸刺激細(xì)菌分泌而生成新的脂類(lèi)，還是試驗(yàn)所添加的脂肪酸，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，海假交替單胞菌生物被膜的形成過(guò)程中添加3種脂肪酸混合物，促進(jìn)了生物被膜胞外脂的產(chǎn)生從而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，添加脂肪酸可以有效提高厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)率，且此結(jié)果對(duì)于了解脂肪酸、細(xì)菌生物被膜及厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)三者間的關(guān)系提供了新的思路，為脂肪酸未來(lái)在厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

4 結(jié)論

1)棕櫚酸、硬脂酸和油酸3種混合脂肪酸抑制了海假交替單胞菌生物被膜的形成，當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，海假交替單胞菌生物被膜的細(xì)菌密度和膜厚達(dá)到最低值。

2)3種脂肪酸混合物質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，導(dǎo)致了海假交替單胞菌生物被膜胞外脂含量顯著升高，從而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)。