王鶴，李戰(zhàn)軍，黃華，徐曉瑩，賀加貝，曹亞男，趙強*

(1.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264006；2.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護總站，山東 煙臺 264003)

近年來，鲆鰈類養(yǎng)殖成功助推了中國海水養(yǎng)殖第四次產(chǎn)業(yè)化浪潮的形成，是北方海水養(yǎng)殖的重要產(chǎn)業(yè)[1]，而大菱鲆Scophthalmusmaximus是鲆鰈類養(yǎng)殖最主要的種類之一。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及種質(zhì)資源的退化，大菱鲆養(yǎng)殖病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了海水養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展。

鏈球菌病是一種全球范圍流行的主要細菌性疾病，在以色列、意大利、美國、日本、韓國等國家的水產(chǎn)養(yǎng)殖中均有報道[2-5]。1958年首次報道了鏈球菌病在魚類(日本養(yǎng)殖虹鱒Oncorhynchusmykiss)中暴發(fā)，之后在牙鲆Paralichthysolivaceus、條紋鱸Dicentrarchuslabrax、美國紅魚Sciaenopsocellatus、黃條鯡Seriolaquinquerodiata等眾多養(yǎng)殖及野生魚類中均有不同程度的感染[6-9]，鏈球菌病已成為危害范圍廣、感染種類多的嚴(yán)重疾病[10]。魚類鏈球菌病是可由不同種屬病原菌引起的具有中樞神經(jīng)損傷的類似病征，主要臨床癥狀為眼球突出和腦膜腦炎[11]。據(jù)報道，可引起溫水性(水溫高于15 ℃)鏈球菌病的病原菌有：格氏乳球菌Lactococcusgarvieae、魚乳球菌Lactococcuspiscium、鮭漫游球菌Vagococcussalmoninarum、海豚鏈球菌Streptococcusiniae、無乳鏈球菌Streptococcusagalactiac、副乳房鏈球菌Streptococcusparauberis等[12]。副乳房鏈球菌隸屬于鏈球菌科Streptococcaceae鏈球菌屬Streptococcus，是一種球狀革蘭氏陽性菌。最初研究者認(rèn)為副乳房鏈球菌是引起牛乳房炎的主要病原之一，1993年西班牙養(yǎng)殖大菱鲆暴發(fā)鏈球菌病，研究者分離到該菌，并將其認(rèn)定為魚類病原菌[13]。目前，副乳房鏈球菌被認(rèn)為是引起魚類鏈球菌病的主要病原菌之一，尤其是引起日本和韓國養(yǎng)殖魚類鏈球菌病的主要病原[5,7]。

多年來，中國還未見由副乳房鏈球菌引起魚類鏈球菌感染的報道。2019年在對山東省煙臺市大菱鲆主產(chǎn)區(qū)常規(guī)病害監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)某區(qū)周邊養(yǎng)殖場有以眼球突出、下頜紅腫、腹部膨脹為主要癥狀的死亡病例。本研究中，以自然發(fā)病大菱鲆為試驗材料，分離純化獲得1株優(yōu)勢菌，通過臨床癥狀觀察、生理生化鑒定、16S rRNA序列分析、特異性引物擴增等，鑒定其為副乳房鏈球菌。這也是中國副乳房鏈球菌對養(yǎng)殖大菱鲆自然感染致病的首次報道，本研究中通過對分離菌株開展毒力基因檢測、血清學(xué)鑒定、抗生素敏感性測試等，探究了大菱鲆感染副乳房鏈球菌的發(fā)病原因，以期為該病的有效防治與致病機制研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年7月，在山東省煙臺市大菱鲆主產(chǎn)地的深井海水室內(nèi)流水養(yǎng)殖車間，采集到患病大菱鲆樣品。養(yǎng)殖水溫為17 ℃，養(yǎng)殖密度約為20 kg/m2，患病個體體質(zhì)量為195～535 g，平均體質(zhì)量為408 g。健康大菱鲆購自煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司(大菱鲆國家級良種場)，平均體質(zhì)量為351.1 g，平均體長為27.4 cm，養(yǎng)殖水溫為(17±1)℃。

腦心浸液培養(yǎng)基(brian heart infusion，BHI)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(muller hinton，MH)、革蘭氏染色試劑盒均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生理生化鑒定管、藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒、PCR擴增相關(guān)試劑購自寶生物(大連)有限公司；試驗用引物及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 取有典型癥狀的瀕死個體，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭腹部，解剖內(nèi)臟，取其肝、腎、脾、腦、眼等組織，用無菌水沖洗、研磨后于BHI瓊脂平板劃線，28 ℃下倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄菌落形態(tài)特征，取優(yōu)勢菌純化培養(yǎng)。經(jīng)2～3次純化后接種于體積分?jǐn)?shù)為5%的羊血平板中觀察溶血特性，同時用終體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油保種，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定 用革蘭氏染色法對菌株染色觀察，根據(jù)形態(tài)特征初步判斷細菌種類。應(yīng)用生理生化鑒定管測定菌株生理生化特性，進一步判斷細菌種屬。按照細菌基因組DNA提取試劑盒要求，用滅菌生理鹽水將活化好的菌株調(diào)整至總密度約109CFU/mL，提取菌液DNA，使用16S rRNA通用引物(27F:5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′，1492R: 5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′)擴增(表1)，經(jīng)測序后于NCBI網(wǎng)站進行Nucleotide Blast同源性分析，用MEGA 6.0 軟件比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選取基于23S rRNA、伴侶蛋白60(chaperonin 60, Cpn 60)和超氧化物歧化酶A(superoxide dismutase A, Sod A)基因片段設(shè)計的3對副乳房鏈球菌特異性引物進行擴增，PCR擴增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期片段一致的，可進行測序驗證。結(jié)合革蘭氏染色、生理生化特性、16S rRNA系統(tǒng)進化關(guān)系及特異性引物擴增結(jié)果等綜合判定分離菌株的種屬。

1.2.3 人工回歸感染試驗 將分離株于BHI平板涂布培養(yǎng)24～48 h，用滅菌生理鹽水沖洗純培養(yǎng)物制成菌懸液，平板計數(shù)。將菌懸液配制成6.3×107、6.3×108、6.3×109、6.3×1010CFU/mL 4個濃度，通過腹腔注射進行人工感染。選取與患病個體體質(zhì)量接近的健康大菱鲆作為回歸感染對象，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)一周后，隨機分為5組，每組10尾，4個試驗組每尾魚注射梯度菌懸液0.1 mL，對照組魚注射等體積的無菌生理鹽水。人工感染后養(yǎng)殖水溫為(18.0±0.5)℃，每天換水并記錄發(fā)病死亡情況，及時剖檢死亡個體，再次取其肝、脾、腎等典型病變組織進行病原檢測。

1.2.4 毒力基因檢測 檢測分離菌株的C5a肽基因(scpB)、αC蛋白基因(bca)、βC蛋白基因(bac)、層粘連蛋白結(jié)合蛋白基因(lmb)、纖維蛋白結(jié)合蛋白A基因(fbsA)、CAMP基因(cfb)、莢膜多糖基因(cpsD)、黏附和毒力蛋白A基因(pavA)、細菌免疫原性黏附素基因(bibA)、表面免疫相關(guān)蛋白基因(sip)、β溶血素基因(cylE)及透明質(zhì)酸酶基因(hylB)等12個毒力相關(guān)基因的攜帶情況，其中，sip基因和bibA基因的PCR擴增條件分別參考彭民毅[16]和常瑞祥[17]的方法，其余毒力基因引物及擴增條件均參考Godoy等[18]的方法。用15 g/L瓊脂糖電泳檢測，紫外凝膠成像拍照后，將與預(yù)期目的片段大小一致的PCR擴增產(chǎn)物進行測序驗證。

1.2.5 血清型檢測 按照Tu等[19]基于多糖聚合酶(WZY)基因設(shè)計的副乳房鏈球菌不同血清型引物(表2)，對本研究中的分離株開展血清型鑒定。

表2 不同血清型的引物序列

1.2.6 藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)推薦的紙片擴散法(Kirby-Bauer, K-B)操作標(biāo)準(zhǔn)進行抗生素藥物敏感性測試。用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒎蛛x菌株配制成濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液，均勻涂布于MH平板，貼藥敏紙片，于28 ℃下培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小。測試用抗生素共計10類23種，每種藥物設(shè)置4個重復(fù)。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定藥物敏感性，標(biāo)準(zhǔn)未涵蓋部分參照王巧煌[20]的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀與解剖觀察

患病大菱鲆表現(xiàn)為食欲減退，體色發(fā)黑，游泳狀態(tài)失衡、打轉(zhuǎn)，具眼球突出、下頜紅腫及腹部膨大等特征，個別鰭條基部出血、體表潰瘍(圖1)。剖檢發(fā)現(xiàn)，肝呈花斑狀充血，脾腫大、顏色暗黑，腹腔腹水。取樣車間患該癥狀大菱鲆約占車間養(yǎng)殖總量的3%，10 d內(nèi)患病個體死亡率約為75%。

2.2 表型特征及生理生化反應(yīng)

試驗中經(jīng)病原菌分離純化，獲得1株優(yōu)勢菌，命名為BH2-4。該菌株在BHI平板上形成圓形、半透明、乳白色、微隆起菌落，菌落表面光滑濕潤，邊緣整齊，直徑為0.5～0.8 mm。革蘭氏染色后顯微鏡檢為紫色、球形、鏈狀細菌，在體積分?jǐn)?shù)5%的羊血平板中不溶血(圖2)。

A—BHI培養(yǎng)基菌落形態(tài)；B—5%羊血培養(yǎng)基中菌落形態(tài)；C—革蘭氏染色顯微觀察；a—圖A箭頭處放大；b—圖B箭頭處放大；c—圖C箭頭處放大。

生理生化反應(yīng)結(jié)果顯示：在10 ℃、45 ℃、pH 9.6及膽汁中不能生長，可在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%的NaCl中生長；能水解七葉苷，不能水解精氨酸、賴氨酸；能利用蔗糖、甘露醇、葡萄糖、山梨糖、蕈糖產(chǎn)酸，不能利用枸櫞酸、鼠李糖、蜜二糖、肌醇、阿拉伯糖、木糖；具堿性磷酸酶活性，不具β-半乳糖苷酶活性，不產(chǎn)生吲哚反應(yīng)等(表3)。

表3 菌株BH2-4的生理生化特性

2.3 分子特征鑒定

應(yīng)用通用引物擴增BH2-4分離株的16S rRNA基因，獲得約1 500 bp的片段，PCR產(chǎn)物純化測序及NCBI數(shù)據(jù)庫在線比對，結(jié)果顯示，菌株BH2-4的16S rRNA與S.parauberisCIFT MFB10119、F21、RP25、DSM631、LMG14376株同源性最高(GenBank登錄號分別為KP240952.1、KP137361.1、JQ988835.1、AY58447.1、AY942573.1)，一致性均為100%?；诟比榉挎溓蚓⑷榉挎溓蚓鶶.beris、海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌S.dysgactiae等菌株16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示，分離菌株與副乳房鏈球菌5條序列聚為一支后再與乳房鏈球菌聚為一支。

圖3 基于16S rRNA序列構(gòu)建的菌株BH2-4系統(tǒng)發(fā)育樹

分離株BH2-4的23S rRNA、cpn60、SodA基因序列擴增，分別得到片段大小為718、400、254 bp的產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖4。

M—DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1—Sod A基因特異性引物擴增；2—23S rRNA基因特異性引物擴增；3—cpn 60基因特異性引物擴增。

2.4 人工回感試驗

用不同濃度的菌液人工感染健康大菱鲆后，各組試驗魚伏于池底，對外界干擾反應(yīng)遲緩，受強烈刺激后反應(yīng)劇烈，出現(xiàn)無方向性竄游甚至撞壁現(xiàn)象。注射48 h后部分大菱鲆出現(xiàn)鰭條充血、眼球突出、下頜紅腫、腹部膨大、內(nèi)臟出血、脾腫大等癥狀，與自然感染發(fā)病魚臨床癥狀及剖解病變相似，各菌濃度組感染后癥狀詳見表4和圖5。

表4 不同濃度菌株人工感染健康大菱鲆后的臨床特征

A—下頜紅腫充血；B—眼球突出；C—肝臟出血；D—腹脹；E—脾臟腫大有白點。

從圖6可見：6.3×1010CFU/mL最高菌濃度組在第6天開始出現(xiàn)死亡，死亡高峰出現(xiàn)在第10～11天，第13天時全部死亡；6.3×109CFU/mL菌濃度組第9天開始出現(xiàn)死亡，第15天時累計死亡率為90%。根據(jù)各濃度組死亡情況，采用改良寇氏法計算得到菌株BH2-4對受試魚的LD50為6.9×108CFU/mL。從人工感染發(fā)病死亡魚體的脾臟、腎臟等組織再次分離到回歸感染所用菌株。

2.5 分離菌株的毒力基因型

分離菌株BH2-4的毒力基因型為scpB--bca--bac--lmb--fbsA--cfb--cpsD--pavA--bibA+-sip+-cylE--hylB+。本研究中選取了12個與鏈球菌相關(guān)的毒力基因，僅檢測出sip、hylB和bibA3種，其余基因檢測均為陰性(圖7)。

M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—sip基因；2—hyl B基因；3—bib A基因。

2.6 血清學(xué)檢測結(jié)果

根據(jù)日本學(xué)者的研究結(jié)果，副乳房鏈球菌血清型可分為Ⅰ型、Ⅱ型和未分型(non-typed, NT)3種，其中，血清型Ⅰ又可分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc 3種亞型[21]。應(yīng)用WZY基因引物進行特異性擴增，可有效鑒別Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅱ型[19]。本研究中分離株BH2-4應(yīng)用上述引物進行血清型擴增并未得到明顯PCR產(chǎn)物，無法鑒別其血清型。

2.7 藥敏試驗結(jié)果

從表5可見：菌株BH2-4對10類23種測試抗生素的敏感性存在差異，對β-內(nèi)酰胺類5種、喹諾酮類4種、四環(huán)素類1種、大環(huán)內(nèi)酯類1種、多肽類1種、利福霉素類1種、氯霉素類1種在內(nèi)的7類14種抗生素類藥物敏感；對包括氨基糖苷類3種、磺胺類2種及呋喃類1種在內(nèi)的3類6種抗生素耐藥；對諾氟沙星、強力霉素、多粘菌素B中度敏感。

表5 菌株BH2-4對10類23種抗生素的敏感性(n=4)

3 討論

3.1 副乳房鏈球菌的鑒定與流行病學(xué)

副乳房鏈球菌最初被認(rèn)為是乳房鏈球菌Ⅱ型，具有與乳房鏈球菌相似的生理生化特性，直到1990年Williams等[22]通過反轉(zhuǎn)錄酶序列分析，發(fā)現(xiàn)二者在系統(tǒng)發(fā)育上截然不同，由此提出新物種——副乳房鏈球菌。本研究中的生理生化鑒定結(jié)果與Williams等[22]對副乳房鏈球菌新物種中的描述一致。盡管本研究中分離株BH2-4表現(xiàn)為γ溶血，與近年來報道的副乳房鏈球菌溶血特性不一致，但與物種鑒定描述中的“γ溶血或微弱的α溶血”吻合。Nho等[7]研究牙鲆源副乳房鏈球菌時發(fā)現(xiàn)，從有典型鏈球菌癥狀患病牙鲆中分離到的菌株具α溶血特性，但回歸感染后再次從瀕死或死亡牙鲆分離到的菌株則表現(xiàn)為不溶血。有研究表明，海豚源鏈球菌的溶血特性與血平板中添加的血液類型及基礎(chǔ)培養(yǎng)基有關(guān)[23]。海豚源鏈球菌在添加牛血或人血的瓊脂平板中呈α溶血或部分α溶血，而在添加羊血的平板中則呈β溶血；在體積分?jǐn)?shù)為3%的馬血心浸液血平板中呈β溶血，而在添加同種同等比例血液的Todd-Hewitt平板中呈α溶血[24]。

魚類鏈球菌感染泛指以敗血癥、腦膜炎等為主要癥狀的相似但又不盡相同的病癥，據(jù)統(tǒng)計至少6種不同的病原菌均可誘發(fā)鏈球菌感染[14]。鏈球菌種類的多樣性較好地解釋了僅通過表型鑒定鏈球菌病的難點所在，受生長速度、接種水平和潛伏期等因素影響，基于生理生化、抗原特性的病原菌鑒別較難精確鑒定到種屬水平[11,25]。在分子鑒定方法中，候選基因測序非常適合細菌的鑒定，分子鑒定是優(yōu)于傳統(tǒng)理化方法的最佳選擇，并廣泛應(yīng)用于鏈球菌中[11-12,14]。本研究中應(yīng)用Mata等[14]、Alber等[15]基于23S rRNA、伴侶蛋白60(cpn60)和超氧化物歧化酶A(SodA)基因片段設(shè)計的副乳房鏈球菌特異性引物擴增得到了預(yù)期目的片段大小的條帶，與他人應(yīng)用該片段擴增的結(jié)果一致[7,26-27]。尤其23S rRNA基因退火溫度從50 ℃[26]至60 ℃[27]均能得到穩(wěn)定的擴增結(jié)果，是鑒定副乳房鏈球菌特異性強且穩(wěn)定性好的理想基因。

副乳房鏈球菌致病范圍較廣，曾有牛、豬、魚等感染致病的報道[28-30]。以前中國未見魚源副乳房鏈球菌致病報道，但日本和韓國養(yǎng)殖的牙鲆鏈球菌感染多由該菌引起，曾造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[19,21]。副乳房鏈球菌感染分急性感染和慢性感染兩種，急性感染3～7 d內(nèi)死亡率超過50%，慢性感染數(shù)周內(nèi)只有少量死亡[30]。魚類感染該鏈球菌后，一般表現(xiàn)為眼球突出、腹水腹脹、脾臟腎臟腫脹或蒼白、內(nèi)源性或外源性出血等癥狀[13,31-32]。本研究中，BH2-4株回歸感染亦出現(xiàn)類似病癥，且與分離到該菌株的自然發(fā)病癥狀相似。研究表明，副乳房鏈球菌人工感染的死亡率與注射部位、水溫密切相關(guān)，Mori等[33]試驗結(jié)果表明，背鰭基部注射死亡率高于腹腔注射；Kim等[31]報道，23～24 ℃水溫下副乳房鏈球菌感染牙鲆的LD50為1×102～1×103CFU/mL，Han等[34]報道，21 ℃時不同血清型副乳房鏈球菌感染的半致死濃度分別為107、108、109CFU/mL，水溫在26 ℃時的感染死亡率顯著高于22 ℃[32]。本研究中，人工感染水溫為(18.0±0.5)℃，腹腔注射菌株BH2-4對大菱鲆的LD50為6.9×108CFU/mL，與Han等[34]的研究結(jié)果相近。此外，土耳其、北美洲亦有從健康魚體中分離到副乳房鏈球菌的報道，但用從健康條紋鱸魚中分離到的副乳房鏈球菌人工感染卻并未導(dǎo)致發(fā)病，由此分析，分離得到病原菌的機體可能是致病菌攜帶者或曾患病痊愈者，也可能條紋鱸不是副乳房鏈球菌的敏感宿主[11,26]。

3.2 副乳房鏈球菌毒力基因與血清型

透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)屬堿性糖蛋白類蛋白水解酶，可以特異性地分解細胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸(hyaluronidase acid)，為細菌生長繁殖提供必需的碳源和能量[35]，是細菌致病的重要毒力因子，尤其在鏈球菌等革蘭氏陽性菌的致病機制中發(fā)揮重要作用[36]。研究表明，透明質(zhì)酸酶B(hyl B)是無乳鏈球菌重要的毒力因子之一，且不同來源的無乳鏈球菌hylB基因具有高度的保守性，通過對其蛋白表達及抗原性分析可為疫苗的研制提供良好基礎(chǔ)[37]。表面免疫原性蛋白(surface immunogenic protein，Sip)，是暴露于菌體表面的一類免疫相關(guān)蛋白，與細菌對宿主的黏附、定植有關(guān)[38]，因其具有高度的保守性，廣泛分布于人源和牛源的多個血清型無乳鏈球菌菌株中，是研究疫苗的良好候選靶抗原[39]。B族鏈球菌細胞表面可產(chǎn)生免疫原性黏附蛋白(GBS immunogenic bacterial adhesion, Bib A)，能促進B族鏈球菌吸附到宿主細胞表面[17]，與C4結(jié)合蛋白特異性結(jié)合，對其抵抗機體吞噬及毒理作用發(fā)揮起到關(guān)鍵作用，缺失bibA基因的菌株存活及抗吞噬作用明顯降低[40]。本研究中測定了分離株BH2-4對鏈球菌12種常見毒力基因的攜帶情況，結(jié)果只檢測出上述3種基因(sip、hylB、bibA)，其余孔毒素(cfb、cylE)、促進免疫逃避因子(cpsD、scpB)或黏附因子(fbsA、lmb、bca、bac、pavA)均未檢出。有研究表明，鏈球菌的致病力取決于細菌在宿主免疫細胞中的存活及避免被宿主細胞殺死而建立感染、誘導(dǎo)細胞凋亡的能力[41-42]。海豚鏈球菌的致病力完全取決于其毒力因子，對其菌株致病力的判斷可以通過檢測毒力因子加以辨別[43]，而副乳房鏈球菌的相關(guān)研究報道較少，其致病機理與毒力基因關(guān)聯(lián)度有待進一步研究。

遺傳變異源于堿基的突變、插入或缺失，這些變異可能會影響進化趨勢，或者說菌株的血清型與毒力間可能存在聯(lián)系[42]。日本學(xué)者[21,44]將本土牙鲆源副乳房鏈球菌血清型進行了詳細分類，可分為3大類5種不同類型。Tu等[19]基于多糖聚合酶基因(WZY)設(shè)計的引物可有效區(qū)分血清型Ⅰ型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc)和Ⅱ型。應(yīng)用該引物擴增本研究中分離株并不能得到明顯的PCR產(chǎn)物，表明BH2-4株與日本牙鲆源副乳房鏈球菌的WZY基因可能存在差異。韓國學(xué)者在兔抗血清凝集試驗中發(fā)現(xiàn)本土牙鲆源副乳房鏈球菌血清型亦可分為Ⅰ、Ⅱ兩型，Ⅰ型毒力強于Ⅱ型，其毒力差異可能與細胞表面包膜厚度不同有關(guān)[44]。在對血清學(xué)相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，副乳房鏈球菌莢膜機體抗血清殺傷活性和抗巨噬細胞吞噬能力有關(guān)[45]。莢膜多糖參與血清學(xué)反應(yīng)，莢膜多糖結(jié)構(gòu)的變異可能是導(dǎo)致血清學(xué)差異的原因之一[46]，未分型副乳房鏈球菌未能成功分型的原因可能與其莢膜結(jié)構(gòu)缺失有關(guān)。

3.3 藥物敏感性

目前，對鏈球菌的防治主要以抗菌藥物為主，藥物的敏感性試驗對抗菌藥物的選擇具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究中，分離得到的菌株BH2-4菌除對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素3種氨基糖苷類藥物，磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明2種磺胺類藥物及呋喃類的呋喃唑酮耐藥外，對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、利福霉素類的18種測試藥物均敏感(其中包括4種中度敏感)，在耐藥基因攜帶方面，檢測到BH2-4株攜帶磺胺類sul1和喹諾酮類gyrA兩種耐藥基因(檢測結(jié)果未列出)。Lee等[47]研究韓國牙鲆源副乳房鏈球菌時發(fā)現(xiàn)，其分離株對氨芐西林、阿莫西林、多西環(huán)素、土霉素、慶大霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明等藥物存在多重耐藥現(xiàn)象；土耳其虹鱒源副乳房鏈球菌分離株對萬古霉素、紅霉素敏感，對依諾沙星、土霉素和氯霉素耐藥[11]；野生條紋鱸分離株對復(fù)方新諾明耐藥，對磺胺類藥物普遍中度敏感[26]；86株韓國牙鲆源副乳房鏈球菌中，63%的菌株對四環(huán)素耐藥，58%的菌株對紅霉素耐藥，16%的菌株對青霉素耐藥[30]；370株韓國黃尾鰤源γ溶血鏈球菌中，17%的菌株對大環(huán)內(nèi)酯、利霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素耐藥[4]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論相符，分離的菌株BH2-4對藥物比較敏感，并未出現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥。盡管應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、利福霉素類藥物均能起到較好的治療效果，但其中的頭孢曲松、頭孢拉啶、頭孢哌酮、諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、紅霉素等敏感藥物已在水產(chǎn)中明令禁止使用；在其他藥物的選擇及使用中應(yīng)遵循水產(chǎn)用藥相關(guān)規(guī)定或參照最新版獸藥典。

4 結(jié)論

1)本研究中從以突眼、腹水、紅腫為主要癥狀的患病大菱鲆中獲得的優(yōu)勢菌株BH2-4為γ溶血的革蘭氏陽性菌，具有與副乳房鏈球菌一致的生理生化特性。

2)經(jīng)16S rRNA通用引物擴增、Blast在線比對，鏈球菌特異性引物擴增等，綜合生理生化結(jié)果，鑒定優(yōu)勢株BH2-4為副乳房鏈球菌Streptococcusparauberis。

3)BH2-4的毒力基因型為scpB--bca--bac--lmb--fbsA--cfb--cpsD--pavA--bibA+-sip+-cylE--hylB+。應(yīng)用WZY基因引物無法有效鑒別BH2-4的血清型。

4)腹腔注射健康大菱鲆，半致死濃度LD50為6.9×108CFU/mL。

5)根據(jù)藥物敏感性測試結(jié)果，在副乳房鏈球菌引起的大菱鲆鏈球菌病防治中，推薦使用恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)，并執(zhí)行500度日的休藥期。