龍婷 張慧　　彭露　　唐石歡　　謝巍偉　　賀育蘭　　廖婷　　李卓敏　　劉玲

[關(guān)鍵詞] 精子DFI;IVF-ET;ICSI;妊娠結(jié)局

[中圖分類號(hào)] R711? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）15-0104-05

Effect of sperm DNA damage on pregnancy outcome of IVF-ET/ICSI assisted fertility patients

LONG Ting1， 2? ?ZHANG Hui2? ?PENG Lu2? ?TANG Shihuan2? ?XIE Weiwei2? ?HE Yulan2? ?LIAO Ting2? ?LI Zhuomin2? ?LIU Ling2? ?TANG Xian2? ?ZHANG Xianping2

1.Jishou University School of Medicine， Jishou? ?416000， China; 2.Reproductive Medicine Center，Loudi Central Hospital in Hunan Province， Loudi? ?417000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of sperm DNA damage on pregnancy outcome of IVF-ET/ICSI patients. Methods A total of 63 patients who underwent IVF-ET/ICSI in Loudi Central Hospital from August 2019 to September 2020 were enrolled. They were divided into three groups according to the level of DFI， including group A： DFI<25% （n=34）， group B： 25%≤DFI≤35% （n=18）， group C： DFI>35% （n=11）. The differences in semen routine analysis （abstinence time， sperm concentration， total motility， PR%）， normal fertilization rate， cleavage rate， available embryo rate， high-quality embryo rate， blastocyst formation rate， implantation rate and clinical pregnancy rate among three groups were compared. Results There was no statistically significant difference between the three groups in general data， including male and female age， BMI （P>0.05）. The difference in abstinence time and sperm concentration between group A and B was not statistically significant（P>0.05）. The vitality and PR% of group C were lower than those of group A and B， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Correlation analysis showed that sperm DFI was negatively correlated with total vitality and PR%（r were -0.362 and -0.290， P<0.05）. Sperm DFI had no correlation with abstinence time and sperm concentration（P>0.05）. The differences in normal fertilization rate， cleavage rate， and usable embryo rate in the three groups were not statistically significant（P>0.05）. The high quality embryo rate and blastocyst formation rate of group B were lower than those of group A， and the difference was statistically significant（P<0.05）.The high-quality embryo rate， blastocyst formation rate， implantation rate and clinical pregnancy rate of group C were all lower than group A， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in indicators among other groups（P>0.05）. Conclusion Sperm DNA damage is negatively correlated with total motility and PR%. Increased sperm DNA damage may lead to a decrease in implantation rate and clinical pregnancy rate in IVF-ET/ICSI patients.

[Key words] Sperm DFI; IVF-ET; ICSI; Pregnancy outcome

女性無(wú)避孕性生活至少12個(gè)月而未孕，稱為不孕癥，在男性則稱為不育癥[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界每年約有6000萬(wàn)余對(duì)夫婦存在生育問(wèn)題，其中男性因素不育患者可高達(dá)50%左右[2]。目前精液常規(guī)分析仍是評(píng)估男性不育的重要參考指標(biāo)，但不能全面反應(yīng)精子的質(zhì)量和功能，缺乏對(duì)精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)如精子DNA的評(píng)估[3]。而精子DNA是男方遺傳信息的載體，在受到內(nèi)、外源性不利因素影響時(shí)會(huì)形成DNA碎片。目前評(píng)判精子DNA碎片的常用指標(biāo)為DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）。本研究通過(guò)檢測(cè)精液常規(guī)分析及精子DFI，探討精子DNA損傷對(duì)常規(guī)體外受精-胚胎移植（In vitro fertilization embyo transfer，IVF-ET）和卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）患者助孕治療后正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率及臨床妊娠率的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象? 選取2019年8月至2020年9月在婁底市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET/ICSI助孕患者共63周期。本研究經(jīng)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并同意，行IVF-ET/ICSI治療的所有患者夫妻雙方均簽署知情同意書。

1.1.2 IVF-ET/ICSI適應(yīng)證[4]? ①輸卵管梗阻;②排卵障礙;③子宮內(nèi)膜異位癥;④男方為少、弱精子癥;⑤免疫性不孕（育）。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)? 女方因素：①單純?yōu)榕枨换蜉斅压芤蛩夭辉?②月經(jīng)規(guī)律、卵巢儲(chǔ)備功能正常;③染色體正常。男方因素：染色體正常。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)? ①診斷為多囊卵巢綜合征;②患有嚴(yán)重的呼吸、心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等;③睪丸和睪丸后性因素導(dǎo)致的不育;④患有外傷或感染性疾病;⑤男女雙方任何一方有輔助IVF-ET/ICSI治療禁忌的患者。

1.2 方法

1.2.1 精液采集與分析? 男方在禁欲2～7 d后，通過(guò)手淫收集完整的精液樣本，取精前應(yīng)要求研究對(duì)象排空膀胱、洗凈雙手、清洗陰莖，使用統(tǒng)一的無(wú)菌標(biāo)本杯收集完整的精液。取精后立即將樣本送往實(shí)驗(yàn)室，于37℃孵育箱內(nèi)靜置，待精液完全液化后，取小部分精液行精液常規(guī)檢測(cè)及DFI檢測(cè)。精液常規(guī)檢測(cè)根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版[5]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析計(jì)數(shù)，對(duì)于精子濃度過(guò)高的精液樣本（>50×106個(gè)/mL），將其精液稀釋，調(diào)整精子濃度成（1～2）×106個(gè)/mL。

1.2.2 精子DFI檢測(cè)? 采用精子DNA碎片染色質(zhì)擴(kuò)散（SCD）檢測(cè)試劑盒（深圳博銳德公司）檢測(cè)精子DNA損傷情況。①檢測(cè)方法：嚴(yán)格遵循試劑盒的使用說(shuō)明方法進(jìn)行檢測(cè)。②精子DNA碎片判定標(biāo)準(zhǔn)：精子的頭部?jī)H產(chǎn)生較小光暈或無(wú)光量，且單側(cè)光暈的厚度不超過(guò)精子頭部最小直徑的1/3。根據(jù)精子暈輪寬度與頭部橫徑比值，分為大、中、小和無(wú)光暈4個(gè)等級(jí)，大暈輪：暈輪寬度>2/3精子頭部橫徑;中暈輪：暈輪寬度和精子頭部橫徑比值為1/3～2/3;小暈輪：暈輪寬度<1/3精子頭部橫徑。DNA完整的精子產(chǎn)生擴(kuò)散的大暈輪或中暈輪，而DNA損傷的精子不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的暈輪。DFI=（小暈輪精子+無(wú)暈輪精子）/精子總數(shù)×100%。正常參考值：DFI<25%。

1.2.3 精液優(yōu)化處理方法? 取卵當(dāng)日精液采取密度梯度離心后上游法優(yōu)化處理，胚胎培養(yǎng)基及精液處理試劑盒均于SAGE公司采購(gòu)，取卵當(dāng)日患者手淫取精，精液標(biāo)本置于37℃熱臺(tái)至完全液化，鏡下觀察并記錄優(yōu)化處理前精液常規(guī)，分別取1.5 mL的40%梯度試劑和1.5 mL的80%梯度試劑加入15 mL離心管，使之形成界面清晰的兩層，再加入1.5～3.0 mL完全液化后的精液，150 g離心 20 min后，沉淀混勻后再次150 g，5 min離心2次，收集精子沉淀后置于培養(yǎng)箱中上游待用。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 體外受精、胚胎觀察與移植? 女方在本中心常規(guī)行超促排卵方案，經(jīng)陰道B超下監(jiān)測(cè)卵泡，根據(jù)血清激素水平及卵泡的大小來(lái)決定注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）時(shí)機(jī);待卵泡成熟后，肌注HCG 10 000 IU，36～40 h后在陰道B超引導(dǎo)下取卵，同時(shí)男方手淫取精，常規(guī)IVF授精，授精后16～18 h后觀察原核受精情況，0原核（Pronucleus，PN）、1 PN、≥3 PN的為異常受精，2 PN的為正常受精，66～68 h觀察胚胎情況，優(yōu)質(zhì)胚胎卵裂球?yàn)?～10個(gè)、碎片不足20%、無(wú)空泡。取卵后3～5 d按照我中心常規(guī)行新鮮胚胎移植，移植12～14 d抽血查HCG判斷是否生化妊娠，移植28 d行超聲檢查見孕囊以確定臨床妊娠。根據(jù)患者HCG日雌二醇水平、獲卵數(shù)及相關(guān)臨床表現(xiàn)來(lái)評(píng)估患者發(fā)生卵巢過(guò)度刺激綜合征（Ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）的風(fēng)險(xiǎn)，酌情是否取消本周期鮮胚移植。

1.3.2 公式計(jì)算? IVF正常受精率=正常受精數(shù)/獲卵總數(shù)×100%;ICSI正常受精率=正常受精數(shù)/注射MII卵子總數(shù)×100%;卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵子數(shù)×100%;胚胎發(fā)育質(zhì)量：D3日胚胎發(fā)育的形態(tài)作為胚胎發(fā)育質(zhì)量的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，胚胎分為I、Ⅱ、Ⅲ級(jí)胚胎，可利用胚胎率=D3日（I+Ⅱ+Ⅲ級(jí)胚胎）數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3日（I+Ⅱ級(jí)胚胎）數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%;囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%;著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析，應(yīng)用Pearson直線分析DFI與精液參數(shù)的相關(guān)性;計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者一般情況比較

三組的男女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 三組精液常規(guī)參數(shù)比較

三組患者禁欲時(shí)間及精子濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;C組精子總活力和前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（Progressive sperm rate，PR）均低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而A、B組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)性分析

精子DFI與禁欲時(shí)間無(wú)相關(guān)性（r=0.094，P>0.05）;精子DFI與精子濃度無(wú)相關(guān)性（r=-0.063，P>0.05）;精子DFI與總活力呈負(fù)相關(guān)（r=-0.362，P<0.05）;精子DFI與PR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.290，P<0.05）。見表3。

2.4 三組IVF-ET/ICSI患者妊娠結(jié)局比較

三組患者正常受精率、卵裂率及可利用胚胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與A組比較，B組優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚形成率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而著床率和臨床妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），C組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率和臨床妊娠率均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與B組比較，C組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率和臨床妊娠率均略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

目前精液常規(guī)分析為評(píng)估精液質(zhì)量的主要參考指標(biāo)，其主要包括對(duì)精子濃度、總活力及PR的評(píng)估[6]，但其波動(dòng)范圍大，極易受禁欲時(shí)間、外界環(huán)境及生活方式等影響，不能滿足所有場(chǎng)景下對(duì)精子質(zhì)量的檢查要求[7-9]。有研究表明，約15%的男性不育患者精液常規(guī)分析結(jié)果正常[10];在精液參數(shù)正常的患者中，約8%的患者精子DFI水平升高[11]。另有學(xué)者指出，高度完整的精子DNA對(duì)成功受精、維持正常胚胎發(fā)育是不可缺少的[12]。精子DNA的完整性可能直接關(guān)系到男性的生育能力，是評(píng)估精子質(zhì)量的重要參考指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，C組總活力和PR均低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此外精子DFI與精子總活力及PR具有負(fù)相關(guān)，驗(yàn)證了張丹等[13]研究結(jié)論。提示精子DFI越高，精子的前向運(yùn)動(dòng)能力越弱，推測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)可能與精子Na+-K+-ATP酶的濃度有關(guān)，當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，會(huì)引起編碼ATP酶的基因發(fā)生改變，導(dǎo)致ATP酶變性，使ATP不能水解釋放能量，故轉(zhuǎn)運(yùn)到精子尾部的能量就會(huì)減少，從而導(dǎo)致精子前向活動(dòng)能力變?nèi)?。而另有研究[14-15]指出，精子DFI與精液參數(shù)無(wú)相關(guān)性。這可能與納排標(biāo)準(zhǔn)、精子DNA損傷檢測(cè)方法及研究對(duì)象分組不同有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，A、B、C三組的正常受精率、卵裂率及可利用胚胎率比較;差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;C組患者優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、著床率及臨床妊娠率均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與梁泳娜等[16]的研究結(jié)果相符合。李婷婷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，隨著DFI水平增加，IVF受精率、卵裂率顯著下降;但又有研究表明[18-21]，精子DFI不會(huì)對(duì)受精過(guò)程造成影響，與IVF-ET/ICSI妊娠結(jié)局無(wú)相關(guān)性。因此精子DFI與IVF-ET/ICSI胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局是否有關(guān)，臨床尚無(wú)統(tǒng)一定論。本研究發(fā)現(xiàn)，精子DFI升高（≥25%）對(duì)受精卵早期增殖發(fā)育無(wú)明顯影響，但高DFI（>35%）會(huì)導(dǎo)致著床率和臨床妊娠率下降，推測(cè)可能由于成熟卵子受精形成受精卵，繼而卵裂形成2～4細(xì)胞胚胎均依賴卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟階段積累的線粒體RNA，卵母細(xì)胞中具有很高的DNA修復(fù)酶活性，所以一定量的精子DNA損傷可以得到復(fù)制后修復(fù)機(jī)制的修復(fù)。但胚胎發(fā)育至6～8細(xì)胞及囊胚期時(shí)，父源性基因初步表達(dá)，當(dāng)受到內(nèi)、外源性不利因素的影響時(shí)，精子DNA會(huì)發(fā)生單鏈或雙鏈的斷裂，若精子DNA損傷程度超過(guò)卵母細(xì)胞的修復(fù)能力，修復(fù)機(jī)制無(wú)法完全修復(fù)，那么受精卵的基因組中就會(huì)存在新突變體，可致父源基因組完整性異常，帶有DNA碎片的精子能夠與成熟卵母細(xì)胞結(jié)合受精，其中有缺陷的父源基因激活可損害胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致植入前和植入后的胚胎發(fā)育阻滯或停滯，從而影響輔助生殖技術(shù)的結(jié)局[22]。此推測(cè)與Dhawan等[23]研究結(jié)果相吻合。

綜上所述，精子DFI升高可能通過(guò)降低總活力和PR%，導(dǎo)致男性生育力下降，從而可能影響IVF-ET/ICSI患者妊娠結(jié)局。但鑒于本研究的患者數(shù)量有限，后期還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論。

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（收稿日期：2021-01-07）