劉益峰，吳付兵，王 星△，吳佳倫，陳國(guó)強(qiáng)

1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院莆田醫(yī)療區(qū)普外科，福建莆田 351100;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000

胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，缺乏有效的治療手段[1]。胃癌通常起源于胃壁，其早期癥狀不明顯，往往被認(rèn)為是常見(jiàn)的胃疾病，這對(duì)早期胃癌的診斷造成影響[2]。盡管近些年來(lái)在手術(shù)技術(shù)和分子靶向治療等方面獲得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但胃癌患者的總生存率仍不盡如人意[3]。因此，探討胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，尋找影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的靶點(diǎn)，對(duì)提高胃癌的早期診斷率以及改善預(yù)后均有重要意義。大量研究證實(shí)微小RNAs(miRNAs)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，被認(rèn)為發(fā)揮了癌基因或抑癌基因的作用[4]。越來(lái)越多的人關(guān)注了miRNAs在胃癌中的作用，有研究表明miRNAs可能是胃癌診斷和治療監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物[5-6]。miR-3648是人類特有的一種miRNA，在類人猿和其他哺乳動(dòng)物中不存在同源體[7]。有研究表明miR-3648在前列腺癌[8]和膀胱癌[9]中對(duì)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，miR-3648在胃癌中的表達(dá)和診斷價(jià)值，以及在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能有較多未知，本課題組對(duì)此進(jìn)行了研究，旨在為胃癌臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年3月在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院莆田醫(yī)療區(qū)就診并經(jīng)病理學(xué)確診為原發(fā)性胃癌的患者100例，臨床資料見(jiàn)表1?；颊咴谑┬形赴┣谐g(shù)時(shí)，收集患者胃癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本。所有參與者無(wú)其他腫瘤以及肝腎功能不全，在行胃癌切除術(shù)前均未接受免疫治療、放療或化療。記錄患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、血清癌胚抗原(CEA)水平、血清糖類抗原(CA)19-9水平、血清CA724水平。檢查結(jié)果均經(jīng)兩位以上的病理醫(yī)師或檢驗(yàn)醫(yī)師確認(rèn)。所有參與研究者均知情同意，并簽署知情同意書。手術(shù)切下后的組織標(biāo)本在做好標(biāo)記后立即置于液氮中保存，以備用于后續(xù)的RNA抽提。

1.2方法

1.2.1OncomiR在線工具分析胃癌中miR-3648的表達(dá) 應(yīng)用microRNA在線工具OncomiR(http://www.oncomir.org)中的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-3648在胃癌患者和健康者中表達(dá)差異。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-3648的表達(dá) 用Trizol試劑(Invitrogen公司)從組織或細(xì)胞中提取總的RNA，采用Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit(TaKaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用ABI 7500定量PCR儀和SYBR premix Ex TaqTMⅡ Kit(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，定量檢測(cè)組織或細(xì)胞中miR-3648的表達(dá)。以U6基因當(dāng)作內(nèi)部參照，miR-3648在組織或細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法表示。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 采用含有10%胎牛血清(FBS)、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco)培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞MGC-803和BGC-823以及人胃黏膜正常細(xì)胞株GES-1，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3天更換1次培養(yǎng)液。取指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-3648抑制物(inhibitor)和陰性對(duì)照(NC inhibitor)序列(廣州銳博生物)轉(zhuǎn)染MGC-803和BGC-823細(xì)胞的步驟和方法參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)說(shuō)明書。細(xì)胞分為空白(Blank)組、轉(zhuǎn)染NC inhibitor的NC inhibitor組和轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor的miR-3648 inhibitor組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平，從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效率。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞按4 000個(gè)細(xì)胞/孔(加入的細(xì)胞懸液為100 μL)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞置于常規(guī)條件中孵育48 h，隨后每孔加 10 μL CCK-8試劑(上海碧云天)并輕輕混勻，37 ℃避光孵育2 h。用酶標(biāo)讀數(shù)儀(Bio-Rad)檢測(cè)各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞按每孔4 000個(gè)細(xì)胞(加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞懸液)接種于Transwell小室上室，小室下室加入800 μL含10% FBS的血清培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將Tanswell上室取出，小室膜下面的細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，然后用0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，上室內(nèi)膜表面的細(xì)胞用濕棉簽小心擦掉。顯微鏡(Olympus)下對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。檢測(cè)細(xì)胞侵襲時(shí)，預(yù)先鋪上一層Matrige基質(zhì)膠(BD)在Transwell小室的內(nèi)部膜上，其余同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。Matrigel基質(zhì)膠配制和處理參考說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1miR-3648在胃癌中的表達(dá)分析 在線工具OncomiR分析顯示：與健康人群(中位數(shù)為0.04)比較，胃癌患者的miR-3648相對(duì)表達(dá)水平(中位數(shù)為0.54)顯著升高(P<0.05)。qRT-PCR檢測(cè)收集的100例胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本顯示：miR-3648在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平[4.94(2.68～7.15)]顯著高于癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)水平[1.66(1.09～2.31)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別和分化程度的胃癌患者間，胃癌組織中miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但不同腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平的胃癌患者間miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-3648表達(dá)和胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[ n=100,M(P25～P75)]

續(xù)表1 miR-3648表達(dá)和胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[ n=100,M(P25～P75)]

2.3miR-3648相對(duì)表達(dá)水平對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 以胃組織中miR-3648相對(duì)表達(dá)水平作為檢測(cè)指標(biāo)，繪制診斷胃癌的ROC曲線,見(jiàn)圖1。曲線下面積為0.897(95%CI：0.853～0.940)。胃組織中miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平診斷胃癌的最佳截?cái)嘀禐?.02，此時(shí)的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%。

圖1 ROC曲線分析miR-3648對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

2.4miR-3648在胃癌細(xì)胞中表達(dá) 與GES-1細(xì)胞(1.000±0.035)比較，MGC-803和BGC-823細(xì)胞中的miR-3648相對(duì)表達(dá)水平(分別為3.300±0.146、4.430±0.163)均顯著升高(t=26.50、35.65，P<0.05)。

2.5轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor對(duì)胃癌細(xì)胞中miR-3648表達(dá)的影響 MGC-803和BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，qRT-PCR檢測(cè)顯示：Blank組、NC inhibitor組和miR-3648 inhibitor組之間miR-3648相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。與轉(zhuǎn)染NC inhibitor比較，轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor后MGC-803和BGC-823細(xì)胞中miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor對(duì)胃癌細(xì)胞miR-3648相對(duì)表達(dá)水平的影響

2.6抑制miR-3648表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 MGC-803和BGC-823細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后，CCK-8法檢測(cè)顯示：Blank組、NC inhibitor組和miR-3648 inhibitor組之間增殖率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。與轉(zhuǎn)染NC inhibitor后的細(xì)胞增殖率比較，轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor后胃癌MGC-803和BGC-823細(xì)胞增殖率顯著降低(均P<0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，見(jiàn)表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor對(duì)胃癌細(xì)胞增殖率的影響

2.7抑制miR-3648表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 MGC-803和BGC-823細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示：Blank組、NC inhibitor組和miR-3648 inhibitor組間遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表4。與轉(zhuǎn)染NC inhibitor的細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-3648 inhibitor的MGC-803和BGC-823細(xì)胞每視野的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)表4。

圖2 miR-3648抑制對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表4 miR-3648抑制對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響個(gè)/視野)

3 討 論

胃癌是一種多因素疾病，幽門螺桿菌感染、遺傳以及飲酒、吸煙等均可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[10-11]。有研究證實(shí)miRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中扮演著重要的角色[12]。異常表達(dá)的miRNAs影響腫瘤的增殖和侵襲[13]。因此，識(shí)別參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的特異性miRNAs可以為腫瘤的診斷和治療提供線索。miR-3648在多種腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。如SUN等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-3648在人膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁非腫瘤組織。XING等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-3648在前列腺癌組織中高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-3648在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示miR-3648在胃癌中可能發(fā)揮了癌基因的功能。本研究隨后發(fā)現(xiàn)胃癌患者的癌組織標(biāo)本中miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平有關(guān)，表明miR-3648的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)展以及胃癌現(xiàn)有的標(biāo)志物水平有關(guān)。此外，當(dāng)胃組織中miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平為3.02時(shí)，其診斷的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%，提示miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平對(duì)胃癌診斷具有一定的價(jià)值。

異常表達(dá)的miR-3648在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。RASHID等[14]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-3648能下調(diào)抑癌基因APC2表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。MIN等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-3648的過(guò)表達(dá)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化起促進(jìn)作用。在人膀胱癌中，抑制miR-3648的表達(dá)能夠抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。過(guò)表達(dá)miR-3648促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖[8]。本研究表明抑制miR-3648表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這與其在膀胱癌和前列腺癌中的作用相似，證實(shí)了miR-3648在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮癌基因的作用。

然而，本研究具有一定局限性。首先，miR-3648在胃癌中調(diào)控的靶基因仍需進(jìn)一步探討；其次，miR-3648在體內(nèi)對(duì)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的影響還不清楚；最后，胃組織中miR-3648的相對(duì)表達(dá)水平用于胃癌診斷的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%，靈敏度較低，因此需要進(jìn)一步研究miR-3648在胃癌患者血液中的表達(dá)以及其在胃癌中的診斷價(jià)值，或聯(lián)合現(xiàn)有胃癌標(biāo)志物構(gòu)建聯(lián)合診斷模型來(lái)提高診斷靈敏度。

綜上所述，當(dāng)胃組織中miR-3648相對(duì)表達(dá)水平為3.02時(shí)，其診斷的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%。抑制miR-3648表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，因此miR-3648有望成為胃癌診斷和治療監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物。