尹江燕，郭 軼

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，重慶 400016；2.重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院/重慶市急救醫(yī)療中心普外科，重慶 400014

血栓閉塞性脈管炎(TAO)是一種病因尚不明確的主要累及中、小型動(dòng)靜脈的節(jié)段性、炎癥性和閉塞性疾病[1]。近期許多研究發(fā)現(xiàn)，過度自身免疫反應(yīng)誘發(fā)靶器官炎癥進(jìn)而導(dǎo)致的血管痙攣、炎性閉塞和血栓形成與TAO的起病及進(jìn)展密切相關(guān)[2-4]。β干擾素Toll樣受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)信號(hào)通路是Toll樣受體家族重要的下游通路，其被證實(shí)與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)[5-6]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TRIF在TAO患者的腰交感神經(jīng)節(jié)中有高表達(dá)，其通過誘發(fā)神經(jīng)節(jié)炎癥間接地導(dǎo)致血管痙攣，可能參與TAO的發(fā)病過程[7]。但在TAO患者受損最嚴(yán)重的靶器官外周血管組織中TRIF的表達(dá)情況及其意義卻少見報(bào)道，因此本課題組對(duì)TAO患者血管組織中TRIF的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了其在血管組織中的表達(dá)特點(diǎn)，旨在進(jìn)一步闡明TRIF信號(hào)通路與TAO發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和重慶市急救醫(yī)療中心臨床診斷為TAO并行下肢截肢的患者(在術(shù)后病理診斷確診為TAO，排除術(shù)后病理無法確診及確診為其他疾病的患者)作為TAO組，共納入26例，其中男26例、女0例，年齡36～52歲(中位年齡42.2歲)。選取同期重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和重慶市急救醫(yī)療中心無血管相關(guān)疾病病史因其他疾病行下肢截肢的患者(術(shù)后病理檢查均排除血管相關(guān)疾病)作為對(duì)照組，共納入18例，其中男11例、女7例，年齡26～55歲(中位年齡44.5歲)。

1.2儀器與試劑 TRIF、CD31、SAM抗體購(gòu)自Sigma公司，生物素化二抗(博士德，武漢)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(中杉，北京)，RNA提取和擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa)，蛋白質(zhì)裂解試劑盒，BCA蛋白濃度試劑盒，配膠試劑盒，ECL顯影試劑盒(碧云天，江蘇)，熒光采集處理與分析系統(tǒng)(Leicaqwin，德國(guó))。

1.3反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè) 取上述納入研究者血管組織標(biāo)本(均為下肢)，先用Trizol法進(jìn)行總RNA的提取，每50～100 mg組織標(biāo)本碾碎后加入1 mL Trizol試劑行組織裂解，取裂解液加入0.2 mL氯仿，振蕩后室溫放置5 min，4 ℃離心10 min(12 000 r/min)， 轉(zhuǎn)移水相后加入異丙醇再次離心，棄上清液后加入預(yù)冷的75%乙醇洗滌、離心并檢測(cè)RNA濃度。然后按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄和目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物(由上海英駿生物有限公司合成)，TRIF上游引物：5′-AAACCAGCACCAACTACCCA-3′；下游引物：5′-CTTCCAAACTTCACGCTCT-3′；擴(kuò)增片段為293 bp。GAPDH上游引物：5′-AGTCCACTGGCGTCTTCA-3′；下游引物：5′-AGTCCTTCCACGATACCAA-3′；擴(kuò)增片段為232 bp。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min；隨后94 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。最后運(yùn)用Gene凝膠圖像儀進(jìn)行圖像采集、分析、測(cè)量、統(tǒng)計(jì)分析。

1.4Western blot檢測(cè) 取少許新鮮血管組織放入預(yù)先加入1 mL蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑的勻漿器中，冰上研磨后吸取研磨液，冰上孵育10 min，4 ℃離心10 min(12 000 r/min)。吸取上清液用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)量蛋白濃度后分裝。按照1∶5的比例加入上樣緩沖液后置于100 ℃沸水中3 min進(jìn)行蛋白變性。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，每孔上樣量30 μL，60 V、30 min，再用100 V、1 h，PVDF膜100 mA轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入按1∶1 000稀釋的TRIF一抗，4 ℃孵育過夜。加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST清洗后用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光。選用GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，Image Lab凝膠成像分析軟件進(jìn)行圖像掃描與分析。

1.5免疫熒光共聚焦檢測(cè) 取冰凍臨床手術(shù)標(biāo)本組織，用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h后，用15%和30%蔗糖梯度脫水，沉底后進(jìn)行切片。加入5%山羊血清37 ℃，20 min。去血清后加入一抗TRIF抗體(1∶100)，并分別加入CD31和SAM抗體(1∶250)，4 ℃過夜。次日加入二抗，37 ℃，50 min，加入DAPI，37 ℃，6 min。封片后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察和采圖。

2 結(jié) 果

2.1TRIF mRNA和蛋白在TAO組和對(duì)照組患者血管組織中表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，TRIF和內(nèi)參GAPDH的PCR擴(kuò)增片段分別為293、232 bp；TAO組TRIF mRNA的吸光度值為0.831±0.033，明顯高于對(duì)照組TRIF mRNA的吸光度值(0.192±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示，TRIF和內(nèi)參GAPDH的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小分別為66×103、37×103；TAO組TRIF蛋白的吸光度值為0.806±0.015，明顯高于對(duì)照組TRIF蛋白的吸光度值(0.162±0.017)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 TRIF mRNA RT-PCR檢測(cè)的電泳圖

圖2 TRIF蛋白表達(dá)水平檢測(cè)的Western blot圖

2.2TRIF在TAO患者血管組織細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn) 免疫熒光組織染色顯示，在TAO患者血管組織中在可以見到TRIF的高表達(dá)，以SAM染色代表平滑肌，可觀察到兩者共表達(dá)，見圖3。TAO患者血管中膜的平滑肌細(xì)胞可以分泌TRIF蛋白，并且TRIF主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)。

注：a表示細(xì)胞核染色；b為血管組織中TRIF的表達(dá)；c為平滑肌的SAM染色；d表示SAM和TRIF的共表達(dá)情況。

3 討 論

TAO又稱Buerger′s病，于1908年被首次報(bào)道。雖經(jīng)過了一個(gè)多世紀(jì)的探索和研究，TAO的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，其治療效果亟待提高，截肢仍是絕大多數(shù)TAO患者的最終結(jié)局[3,8]。近期許多研究發(fā)現(xiàn)TAO的起病與煙草、細(xì)菌感染及寒冷刺激誘發(fā)的自身免疫性炎癥密切相關(guān)[9]；TAO患者的病理生理改變主要為血管痙攣、血管組織炎性損傷及繼發(fā)血栓形成，但其具體機(jī)制尚不明確[4,10]。因此，自身免疫性炎癥損傷與TAO發(fā)病的相關(guān)性逐漸成為TAO的研究熱點(diǎn)之一。自身免疫性炎癥是復(fù)雜的分子生物過程，多種免疫相關(guān)信號(hào)通路參與其中[11]，Toll樣受體(TLRs)通路是機(jī)體最重要的非特異性固有免疫應(yīng)答途徑，其可通過激活一系列下游信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和自身免疫性炎性反應(yīng)[12]；近期許多研究也發(fā)現(xiàn)TLRs通路與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)[13]。TRIF信號(hào)通路是TLRs最重要的下游通路之一，其主要與TLR4結(jié)合參與多種炎性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病過程[14]，但TRIF通路與TAO的相關(guān)性的相關(guān)研究仍較少。本試驗(yàn)檢測(cè)TRIF在TAO患者血管組織中的表達(dá)情況，初步探討TRIF通路與TAO發(fā)病的相關(guān)性。

在TAO的發(fā)病及進(jìn)展過程中，血管痙攣是最早和最主要的臨床表現(xiàn)之一，而且血管痙攣貫穿TAO的整個(gè)病程[15]。絕大多數(shù)TAO患者起病初期以血管痙攣為主要表現(xiàn)，血管痙攣與交感神經(jīng)功能紊亂密切相關(guān)，因此，早期的TAO患者行腰交感神經(jīng)切除術(shù)或用藥物阻斷缺血患肢的周圍交感神經(jīng)可明顯改善下肢血管痙攣進(jìn)而減輕缺血癥狀[15-16]，但誘發(fā)及促進(jìn)TAO患者血管痙攣的機(jī)制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)，TAO患者血管外膜神經(jīng)分布異常和兒茶酚胺的缺乏可能是導(dǎo)致其血管痙攣的重要因素[17]。支配四肢小血管舒縮功能的神經(jīng)纖維來自交感神經(jīng)節(jié)，主要是交感縮血管神經(jīng)纖維，若神經(jīng)節(jié)發(fā)生病變，可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)炎癥性血管痙攣[18]，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TRIF在TAO患者腰交感神經(jīng)節(jié)中高表達(dá)，該通路可能參與神經(jīng)功能異常誘發(fā)TAO患者血管痙攣的發(fā)病過程[7]。

但隨著TAO的進(jìn)展，血管痙攣會(huì)進(jìn)行性加重，而且行腰交感神經(jīng)切除術(shù)或用藥物阻斷患肢的周圍交感神經(jīng)無法緩解血管痙攣。這種現(xiàn)象提示隨著TAO的進(jìn)展，血管痙攣可能存在多因素的聯(lián)合作用。血管平滑肌在血管的收縮中也起重要作用，血管痙攣和血管平滑肌的功能也存在密切相關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌的炎癥或者功能異常均可導(dǎo)致血管痙攣[20]；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)TRL4信號(hào)通路可以參與腦血管痙攣的病理生理過程，其作用機(jī)制可能與TRL4通過TRIF通路激活下游的NF-κB通路進(jìn)而誘發(fā)的平滑肌炎癥有關(guān)[21]。因此，結(jié)合本課題組前期研究，筆者推測(cè)TRIF通路也可能通過誘發(fā)TAO患者血管壁平滑肌的炎性反應(yīng)進(jìn)而加重血管痙攣的發(fā)生。本研究通過檢測(cè)TAO患者血管組織標(biāo)本中TRIF的mRNA、蛋白發(fā)現(xiàn)其TAO患者血管組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。同時(shí)熒光共聚焦顯示TRIF主要在TAO患者血管肌層的平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，在血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞未見明顯表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)TRIF通路可能也可以誘發(fā)血管平滑肌的炎癥進(jìn)而加重TAO患者的血管痙攣，導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。其具體機(jī)制可能是TRIF通路激活其下游的NF-κB通路進(jìn)而活化一系列炎性反應(yīng)。首先NF-κB通路可以誘導(dǎo)激活物蛋白1(AP-1)直接導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞失去彈性并保持僵硬狀態(tài)誘發(fā)持續(xù)性血管痙攣[22]；同時(shí)，NF-κB通路還可以誘導(dǎo)白細(xì)胞分泌大量炎性介質(zhì)如白細(xì)胞介素(IL)家族(IL-1、IL-2、IL-8等)，這些炎性介質(zhì)可以誘發(fā)平滑肌炎性反應(yīng)，引起平滑肌細(xì)胞收縮進(jìn)而導(dǎo)致血管痙攣[23]；最后，NF-κB通路還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子-1(VCAM-1)等炎性介質(zhì)進(jìn)而誘發(fā)血管壁平滑肌細(xì)胞間的炎性黏附導(dǎo)致血管痙攣[24]。但是各種炎性介質(zhì)誘發(fā)的炎性反應(yīng)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞強(qiáng)烈收縮的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，TRIF在TAO患者血管組織的高表達(dá)與TAO的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)。其可能的機(jī)制是TRIF激活下游的NF-κB通路誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生一系列嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，進(jìn)而引導(dǎo)持續(xù)性的血管痙攣導(dǎo)致TAO的發(fā)病及進(jìn)展，但是其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。同時(shí)針對(duì)TRIF的靶向治療可能成為TAO治療的新方法。