譚 瑞，劉 任，彭曉鳳

1.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401320；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室/重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401520

抑郁癥是一個(gè)嚴(yán)重的心理健康問題，也是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題。抑郁癥的發(fā)生與多種機(jī)制有關(guān)。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能失調(diào)[1]、突觸間隙5-羥色胺(5-HT)水平下降[2]、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)下調(diào)[3-5]均是抑郁癥發(fā)病的重要機(jī)制。但目前對(duì)于HPA軸與5-HT和BDNF之間的關(guān)系在抑郁癥發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較少。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平與其合成和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。5-HT由色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶(TPH)代謝合成。但是，色氨酸-TPH代謝途徑合成5-HT減少時(shí)，其另一條代謝途徑，即色氨酸-犬尿氨酸(KYN)合成代償性增加，色氨酸-KYN途徑的限速酶吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)被激活[6]。此外，5-HT的消除方式主要為5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)的再攝取。5-HTT已經(jīng)成為常用抗抑郁藥的作用靶點(diǎn)。但I(xiàn)DO活性增加是否介導(dǎo)了HPA軸功能亢進(jìn)引起的抑郁癥，目前研究較少。本研究擬以皮質(zhì)酮刺激原代海馬神經(jīng)元，模擬HPA軸亢進(jìn)條件，并給予皮質(zhì)酮受體拮抗劑米非司酮(Ru-486)處理，初步確定IDO、BDNF及5-HTT在HPA亢進(jìn)所致抑郁癥中的作用。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD孕鼠，懷孕18 d，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑 DMEM-F12、B27、胎牛血清均購自美國Gibco公司；5’-BrdU、多聚賴氨酸、胰蛋白酶、皮質(zhì)酮、MTT檢測試劑盒均為北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Ru-486為武漢勝天宇生物科技有限公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇省碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix和PCR引物購自Takara生物制劑公司；兔抗大鼠5-HTT、BDNF、IDO多克隆抗體購自博奧森生物科技公司；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自Santa Cruz公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3方法

1.3.1原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定 取懷孕18 d的SD大鼠，處死后迅速剪開腹腔取出胎鼠，分離海馬組織，用0.125%的胰蛋白酶消化，800 r/min離心10 min，按2×106個(gè)/孔的密度接種，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。4 h 后神經(jīng)元貼壁，更換培養(yǎng)液，以后每48 h半量更換培養(yǎng)液。于第7天經(jīng)NeuN抗體(1∶100)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，純度可達(dá)95 %以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.3.2MTT比色法檢測不同濃度皮質(zhì)酮作用不同時(shí)間對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響 神經(jīng)元細(xì)胞按照密度為2×106個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔的培養(yǎng)液為100 μL。于培養(yǎng)第7天加入不同濃度的皮質(zhì)酮(1、5、10、50 μmol/L)分別作用2、 24、48 h后，每孔加入10 μL MTT，避光，37 ℃孵育4 h。吸出培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO，搖床震蕩10 min，至結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀在490 nm波長檢測吸光度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過吸光度值計(jì)算得到細(xì)胞存活率。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測mRNA的表達(dá) 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，加入皮質(zhì)酮(5 μmol/L)，或同時(shí)加入Ru-486(1 μmol/L)，繼續(xù)孵育24 h，按照RNAiso Plus Total RNA提取試劑說明書的操作程序提取總RNA。參照GenBank中大鼠基因序列，由重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Takara生物技術(shù)公司合成并驗(yàn)證,引物序列見表1。按照Takara Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(即Ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)相對(duì)定量公式進(jìn)行計(jì)算，分析結(jié)果。每組重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.3.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 海馬神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)皮質(zhì)酮或皮質(zhì)酮+Ru-486共孵育24 h后，加入RIPA裂解緩沖液，冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，12 000×g 4 ℃離心15 min，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯胺凝膠電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗GAPDH(1∶1 000稀釋)、IDO(1∶1 000稀釋)、5-HTT(1∶1 000稀釋)、BDNF(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，再次洗膜后用ECL發(fā)光試劑顯影，用Image Lab軟件進(jìn)行圖像分析。以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶的灰度比值表示蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。每組重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度皮質(zhì)酮作用不同時(shí)間對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響 MTT比色法檢測顯示，不同濃度皮質(zhì)酮處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞2 h，細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)；處理24 h和48 h，皮質(zhì)酮均濃度依賴性地降低細(xì)胞存活率。皮質(zhì)酮5 μmol/L處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞24 h可明顯降低細(xì)胞存活率(P<0.05)，故以5 μmol/L處理24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.2皮質(zhì)酮對(duì)海馬神經(jīng)元IDO、5-HTT和BDNF mRNA表達(dá)的影響 皮質(zhì)酮5 μmol/L處理細(xì)胞24 h后，海馬神經(jīng)元IDO mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而BDNF mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)，但5-HTT mRNA的表達(dá)沒有明顯變化(P>0.05)。Ru-486 1 μmol/L可逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮的作用，下調(diào)IDO mRNA表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)BDNF mRNA的表達(dá)(P<0.05)。Ru-486處理對(duì)5-HTT的表達(dá)也沒有明顯影響(P>0.05)。見圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與皮質(zhì)酮處理組比較，#P<0.05。

2.3皮質(zhì)酮對(duì)海馬神經(jīng)元IDO、5-HTT和BDNF蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)mRNA表達(dá)的影響類似，皮質(zhì)酮上調(diào)IDO蛋白表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)BDNF蛋白表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)5-HTT蛋白的表達(dá)沒有明顯影響(P>0.05)；給予Ru-486處理后，皮質(zhì)酮對(duì)IDO和BDNF蛋白表達(dá)的作用明顯被逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。Ru-486對(duì)5-HTT蛋白的表達(dá)也沒有明顯影響(P>0.05)。見圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與皮質(zhì)酮處理組比較，#P<0.05。

3 討 論

內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常在抑郁癥的發(fā)生中有重要作用[7-8]。HPA軸學(xué)說認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，下丘腦室旁核神經(jīng)元分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，使垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)，釋放糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)酮/皮質(zhì)酮)。而后，糖皮質(zhì)激素作用于糖皮質(zhì)激素受體，反饋性地調(diào)節(jié)CRH、ACTH的釋放，阻斷其興奮效應(yīng)[9]。而在抑郁發(fā)生時(shí)，由于持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體產(chǎn)生過多糖皮質(zhì)激素，與海馬糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，損傷海馬結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)HPA軸的負(fù)反饋抑制作用減弱，機(jī)體生成更多糖皮質(zhì)激素，HPA軸功能表現(xiàn)亢進(jìn)[10]。海馬是情緒調(diào)節(jié)和學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，HPA軸亢進(jìn)損傷海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能，故抑郁患者出現(xiàn)情緒和認(rèn)知障礙[11]?，F(xiàn)常以皮質(zhì)酮損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞模型研究HPA 軸亢進(jìn)與抑郁的相關(guān)性[12]。本研究結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性損傷神經(jīng)元。皮質(zhì)酮5 μmol/L作用24 h，海馬神經(jīng)元即出現(xiàn)明顯損傷。

單胺學(xué)說是抑郁癥發(fā)生的重要學(xué)說之一。臨床目前使用的抗抑郁藥大多以該學(xué)說為基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)，抑郁患者和動(dòng)物模型體內(nèi)普遍HPA軸亢進(jìn)，血清皮質(zhì)酮/皮質(zhì)酮水平較正常組明顯升高[13]，同時(shí)伴隨5-HT水平下降[14]。但對(duì)于HPA軸亢進(jìn)是否能引起5-HT減少，以及通過何種途徑使5-HT作用下降，目前未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，給予皮質(zhì)酮刺激后，海馬神經(jīng)元IDO mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，且糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑Ru-486可逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮的作用，提示皮質(zhì)酮作用于海馬神經(jīng)元糖皮質(zhì)激素受體，激活I(lǐng)DO，使色氨酸-KYN途徑增強(qiáng)，而色氨酸-TPH途徑減弱，5-HT合成減少。但皮質(zhì)酮對(duì)5-HTT的表達(dá)沒有影響，提示HPA軸亢進(jìn)并不是通過增強(qiáng)5-HTT的作用增加5-HT再攝取來減少5-HT水平。

已有研究證明BDNF下降與抑郁發(fā)生有明顯相關(guān)性。抑郁癥患者5-HT2受體超敏，激活“Gq蛋白-磷脂酶C(PLC)-三磷酸肌醇(IP3)-Ca2+通道”，抑制BDNF合成，損傷神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和突觸可塑性，使抑郁患者工作記憶功能受損[15]。本研究顯示，皮質(zhì)酮作用可使海馬神經(jīng)元BDNF表達(dá)下調(diào)，該作用可被Ru-486逆轉(zhuǎn)，提示HPA軸亢進(jìn)，使5-HT合成減少后，可能通過下調(diào)BDNF表達(dá)，導(dǎo)致抑郁發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果提示皮質(zhì)酮可能通過激活海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體，上調(diào)IDO表達(dá)，減少BDNF表達(dá)，誘導(dǎo)抑郁癥發(fā)生；值得注意的是，皮質(zhì)酮并未直接影響5-HTT的表達(dá)。