路曉琳

(邯鄲市中心醫(yī)院婦二科，河北 邯鄲 056001)

0 引言

在當(dāng)前的諸多研究結(jié)果中可知，F(xiàn)SH在與細(xì)胞表面的特異性FSH受體(FSHR)發(fā)生作用時(shí)，能夠激活胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，并使其發(fā)揮相關(guān)作用，但具體關(guān)于其如何發(fā)生作用的機(jī)制并無相關(guān)研究結(jié)果予以證明。目前可知的是，腫瘤的發(fā)生、擴(kuò)散、死亡以及生成血管和耐藥性生產(chǎn)過程中[1]，磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B(PI3K/AKT)扮演了十分重要的角色。它能夠或直接或間接的影響到細(xì)胞增殖、蛋白合成及凋亡相關(guān)因子等下游分子。而作為AKT具有特殊作用的下游分子之一的核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，控制著信號傳導(dǎo)通路中樞。如果通過對其進(jìn)行的異常活化刺激，可以在使得細(xì)胞增殖、凋亡等方面相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，在使得細(xì)胞的外間質(zhì)收到破壞后使得腫瘤細(xì)胞進(jìn)行浸潤和轉(zhuǎn)移的目的。基于此，本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究FSH是如何通過PI3K/AKT的途徑在NF-κB、p-ART發(fā)生作用，為研究卵巢癌具體的發(fā)病原理及相應(yīng)的從基因方面進(jìn)行治療，提供新的有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢腺癌細(xì)胞、人卵巢癌細(xì)胞株

卵巢腺癌細(xì)胞株為我院婦科實(shí)驗(yàn)室提供；人卵巢癌細(xì)胞株為我院實(shí)驗(yàn)中心所提供，均使用常規(guī)的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備--細(xì)胞總蛋白

(1)選擇卵巢癌細(xì)胞(上皮性)中的SKOV-3、3AO、40mIU/mL FSH和10μmol/L LY294002，隨后單獨(dú)并加入LY294002半小時(shí)，聯(lián)合卵泡刺激素作用分別設(shè)置為一組。此時(shí)設(shè)空白對照組以便對比觀察，分別在48h、24h之后去除培養(yǎng)液。隨后，借助細(xì)胞傳代的方式，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，洗滌次數(shù)2遍，洗滌完成后將適量的消化液加入，借助顯微鏡，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓，并且此時(shí)的細(xì)胞之間連接逐漸減少時(shí)，將2mL的PBS加入其中，起到吹打細(xì)胞之作用，并讓其處于懸浮狀態(tài)。把細(xì)胞懸液進(jìn)行吸出處理，以800-1000 r/分鐘的速度置于離心管進(jìn)行離心操作5min。此時(shí)同時(shí)使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩遍，然后進(jìn)行離心除去。

(2)裂解液1mL，并對應(yīng)將10mL的100mMPMFS加入其中，為獲得更好實(shí)驗(yàn)效果，使細(xì)胞充分裂解，此時(shí)可將離心管借助器具進(jìn)行振蕩混勻的操作，隨后將其處于冰凍環(huán)境中裂解30min。

(3)使離心機(jī)保持4℃，選擇12000轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心5min。

(4)最后，分離出上清并置于干凈的離心管中，保存在-70℃中。

1.2.2 樣本制備--細(xì)胞核蛋白、漿蛋白

(1)取上皮性卵巢癌SKOV-3、3AO培養(yǎng)細(xì)胞5~10×106個/mL，除去培養(yǎng)液。將此時(shí)的細(xì)胞在已經(jīng)冷卻的磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次；把胰酶消化液逐漸加入，如果細(xì)胞出現(xiàn)變圓，并且細(xì)胞之間的連接減少的現(xiàn)象時(shí)，加入2mL的磷酸緩沖鹽溶液對細(xì)胞進(jìn)行吹打。當(dāng)細(xì)胞懸浮后，吸出懸液，放在1.5mL的離心管中；設(shè)置未4℃、1000×g，在離心機(jī)中進(jìn)行4min的離心后，可能取干凈上清，避免殘液存留，估計(jì)細(xì)胞離心后的緊實(shí)細(xì)胞體積；

(2)按照10倍于細(xì)胞壓積的冰浴的Lysis Solution A對細(xì)胞進(jìn)行洗滌操作；在4℃的離心情況下收集細(xì)胞；

(3)按照3倍于細(xì)胞壓積的冰浴的Lysis Solution A懸浮細(xì)胞，在0℃的情況下放置10min；借助顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)七成的細(xì)胞破裂后，此時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行快速混懸數(shù)次。4000×g，15min，通過離心操作去除上清，獲得細(xì)胞核，獲取的上清就是需要制備的樣品，為胞漿蛋白；

(4)加入與細(xì)胞核等體積，冰浴的Lysis Solution B充分混勻，在 0℃的情況下放置 30min，設(shè)置 15000×g，4℃，進(jìn)行15min的離心操作，此時(shí)的上清即為核蛋白提取物；

(5)蛋白定量以取5~10μl核和漿抽提物進(jìn)行操作，將其余分別置于-70℃下進(jìn)行凍存。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，對本次研究的所有重要數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。需要注意的是，計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 四組細(xì)胞株SKOV-3中P-AKT、AKT1/2含量表達(dá)

卵泡刺激素組的SKOV-3中p-AKT含量顯著高于其他三組，對照組與FSH+LY29400兩組相較p-AKT顯著減少，此時(shí)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LY294003組與聯(lián)合組相較無差異，四組AKT1/2蛋白表達(dá)相較不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組細(xì)胞株SKOV-3中P-AKT、AKT1/2含量表達(dá)

2.2 四組細(xì)胞株3AO中P-AKT、AKT1/2含量、蛋白NF-κB含量表達(dá)

3AO細(xì)胞中，p-AKT蛋白表達(dá)，F(xiàn)SH組、LY29400兩組及FSH/LY29400兩組相比較于對照組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P<0.05)。其中，F(xiàn)SH組的p-AKT蛋白表達(dá)相比于其余三組更多一些(P<0.05)；而對照組的表達(dá)明顯多于LY29400兩組、FSH/LY29400兩組(P<0.05)。這幾組之間的AKT1/2蛋白表達(dá)均存在一致性(P>0.05)。見表2?？偺崛〉鞍字?，NF-κB蛋白表達(dá)FSH組相比于對照組及LY29400兩組明顯較少(P<0.05)。而全部的四組中，以及其他組別之間比較存在一致性(P>0.05)。胞核中NF-κB蛋白表達(dá)四組之間，差異較大(P<0.05)，其中，F(xiàn)SH組與其他三組相比，存在表達(dá)明顯增加(P<0.05)；其他三組相較表達(dá)減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，同時(shí)這兩組間的數(shù)據(jù)比較并無不同(P>0.05)；胞漿中NF-κB蛋白表達(dá)FSH組多于其他三組，但組間比較存在一致性(P>0.05)。

表2 四組細(xì)胞株3AO中P-AKT、AKT1/2含量、蛋白NF-κB含量表達(dá)(n=2)

3 討論

AKT對下游分子的糖分代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長與增殖的介導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)以及抑制細(xì)胞的凋零等方面能夠通過參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生作用。而NF-κB作為AKT重要的下游分子之一，根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果可知，激活了PI3K可以磷酸化和活化NF-κB。在特定條件下[2]，即當(dāng)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)中，NF-κB能夠同其抑制性的輔助因子(IκB)進(jìn)行結(jié)合，以達(dá)到促使IκB的降解的作用，使得NF-κB在復(fù)合物中分離，并在細(xì)胞核中定位，恢復(fù)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。與此同時(shí)，IκB被降解后又迅速合成，同時(shí)與NF-κB結(jié)合于細(xì)胞核內(nèi)[3]。NF-κB -IκB此時(shí)形成，其復(fù)合物能往細(xì)胞質(zhì)中移位，NF-κB活化與失活的循環(huán)過程得以持續(xù)和完成。核蛋白NF-κB因?yàn)槠鋵τ诿庖咔虻鞍爪瘦p鏈的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用，也因此被稱之為核轉(zhuǎn)錄因子κB[4]，NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2 (p52/p100)、p65(RelA)、RelB，C-Rel等，都是目前所知的NF-κB家族成員。通過將NF-κBP65與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的抑制蛋白IκB相結(jié)合，可組合為復(fù)合物，將P50的核定位位點(diǎn)進(jìn)行一定掩蓋，其在細(xì)胞質(zhì)中處于非活性狀態(tài)。本研究顯示，卵泡刺激素組的SKOV-3中p-AKT含量顯著高于其他三組，人卵巢癌細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)，卵泡刺激素組、LY29400兩組及FSH/LY29400兩組，相比較于對照組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中，F(xiàn)SH組p-AKT蛋白表達(dá)相比于其余三組較多(P<0.05)；而相對應(yīng)的總提取蛋白中NF-κB蛋白表達(dá)FSH組，相對于對照組及LY29400兩組減少較為明顯(P<0.05)。

綜上所述，F(xiàn)SHR受體存在于SKOV-3、3AO細(xì)胞中，F(xiàn)SH作用于SKOV-3、3AO后，PI3K/Akt途徑成功被激活，p-AKT蛋白表達(dá)量顯著提高的表達(dá)量，促使其下游分子在細(xì)胞核中，NF-κB蛋白的表達(dá)有所增加。