劉曉璇,方 圓,王 瑞

齲病是一種牙體硬組織疾病，主要是由于牙菌斑生物膜附著在牙齒表面產(chǎn)酸，對牙體硬組織造成損傷[1]。早在19世紀(jì)，研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)變異鏈球菌與齲病具有相關(guān)性[2]。變異鏈球菌在口腔中具有極強(qiáng)的附著能力，能在牙面上形成細(xì)菌生物膜，通過利用多種碳水化合物產(chǎn)酸形成低pH值環(huán)境，從而改變口腔內(nèi)環(huán)境，為其他產(chǎn)酸菌和耐酸菌提供有利的生存環(huán)境[3-4]。因此，通過減少變異鏈球菌生長及其生物膜的形成，可以有效預(yù)防齲病的發(fā)生。

氟化鈉(sodium fluoride，NAF)是一種公認(rèn)的雙重功能防齲劑，對牙齒硬組織保護(hù)和口腔微生物調(diào)節(jié)均具有重要作用[5]，NAF既是糖酵解酶抑制劑，又是跨膜質(zhì)子載體，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)酸化來抑制細(xì)菌的生長[6-7]。茶葉作為一種天然的抗齲物質(zhì)，茶多酚已被證實(shí)可以有效防止齲病的形成，甚至抑制齲病的發(fā)展[8]，此外它還具有抑制口腔相關(guān)致齲菌生長的功能。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶多酚中主要的抗微生物單體成分，它具有抑制變異鏈球菌生長繁殖和產(chǎn)酸的作用[9-10]。現(xiàn)有研究顯示NAF與EGCG都具有良好的抗菌性能，因此我們想要探討兩者聯(lián)合應(yīng)用是否能夠?qū)ψ儺愭溓蚓a(chǎn)生協(xié)同抑制作用，增強(qiáng)其抗菌性能，從而減少藥物的使用量。

1 材料與方法

1.1 材料

變異鏈球菌(Streptococcusmutans，UA159)由吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，牛腦心浸出液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)購自北京索萊寶科技有限公司，結(jié)晶紫染料購于珠海迪爾生物工程有限公司，EGCG購自北京索萊寶科技有限公司，NAF購于上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)

將-80 ℃凍存的變異鏈球菌復(fù)蘇后接種于瓊脂板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，接種于BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 NAF與EGCG對變異鏈球菌生長的抑制作用

通過微量稀釋法測量NAF與EGCG對變異鏈球菌生長的抑制作用[11]，在96孔微量滴定板的孔中均加入100 μL變異鏈球菌(1×107CFU/mL)和100 μL系列稀釋的試劑。先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定NAF的濃度范圍為125.000、100.000、62.500、31.250、25.000、15.625 mg/L，EGCG濃度范圍為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/L。將菌液分別和不同濃度的EGCG或NAF試劑在96孔微量滴定板中混合，在37 ℃厭氧環(huán)境下孵育24 h，然后用酶標(biāo)儀測定各孔于600 nm波長處的OD值以評估細(xì)菌生長情況，定性檢測藥物最小抑菌濃度值(minimal inhibition concentration，MIC)，藥物最小抑菌濃度值(MIC50)定義為與對照組相比至少抑制50%細(xì)菌生長的最低藥物濃度。

1.4 NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生長的抑制作用

NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生長的抑制作用通過棋盤微量稀釋法來測定，將菌液與不同濃度的NAF和EGCG混合溶液加入96孔板中，檢測聯(lián)合應(yīng)用時(shí)NAF與EGCG的MIC值，然后計(jì)算分級抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)用來判斷兩者是否有潛在協(xié)同作用[11]。FIC=聯(lián)合用藥時(shí)甲藥MIC/單獨(dú)應(yīng)用甲藥時(shí)MIC+聯(lián)合應(yīng)用乙藥時(shí)MIC/單獨(dú)應(yīng)用乙藥時(shí)MIC。FIC指數(shù)為<0.500、0.500～1.000、1.000～2.000、>2.000時(shí)分別表示協(xié)同、相加、無關(guān)、拮抗作用。

1.5 生物膜的檢測

檢測NAF與EGCG對變異鏈球菌生物膜的抑制作用是將100 μL變異鏈球菌(1×107CFU/mL)與100 μL不同濃度的藥物溶液一同加入96孔板中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定藥物的最終濃度梯度為NAF(125.000、62.500、31.250、15.625 mg/L)、EGCG(125.000、62.500、31.250、15.625 mg/L)、檢測單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對生物膜抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)藥物的濃度分別為(25.0 mg/L NAF、62.5 mg/L EGCG、25.0 mg/L NAF+62.5 mg/L EGCG)，于37 ℃、厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)24 h[12]，吸出上清液，生理鹽水洗滌3次，用戊二醛固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min后用生理鹽水清洗3次，加入95%的乙醇，將板在室溫下?lián)u動(dòng)30 min，用酶標(biāo)儀測量600 nm波長處的OD值。最小生物膜抑制濃度(minimal biofilm inhibitory concentration，MBIC)定義為與未處理的對照相比，至少抑制了50%生物膜(MBIC50)形成時(shí)的藥物濃度。

1.6 NAF與EGCG對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

測定不同濃度的NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用以及單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響[11]，取對數(shù)生長期的變異鏈球菌培養(yǎng)于BHI培養(yǎng)基(含1%蔗糖)中，調(diào)整初始pH值為7.5，每個(gè)試管中各含有4 mL菌液和4 mL不同濃度的藥物溶液，檢測單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對產(chǎn)酸抑制作用時(shí)藥物的濃度分別為(25.0 mg/L NAF、62.5 mg/L EGCG、25.0 mg/L NAF+62.5 mg/L EGCG)，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，每隔4 h測量各個(gè)試管中變異鏈球菌的pH值，即pH1。計(jì)算ΔpH=pH0-pH1，抑制產(chǎn)酸率=(ΔpH對照組-ΔpH實(shí)驗(yàn)組)/ΔpH對照組×100%，并繪制“時(shí)間—pH值”曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并使用t檢驗(yàn)進(jìn)行多組之間均值的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 NAF與EGCG單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生長的影響

NAF對變異鏈球菌生長的抑制作用，從圖1可以看出NAF能夠顯著抑制變異鏈球菌的生長，NAF對變異鏈球菌的MIC值為100 mg/L。

n=3;***:P<0.01

EGCG對變異鏈球菌生長的抑制作用，從圖2可以看出EGCG能夠抑制變異鏈球菌的生長，EGCG對變異鏈球菌MIC值為500 mg/L。

n=3；***：P<0.01

NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用對于變異鏈球菌生長的影響由棋盤微量稀釋法得出NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用時(shí)NAF的MIC值為25.0 mg/L，EGCG的MIC值為62.50 mg/L，而單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，NAF的MIC值為100 mg/L，EGCG的MIC值為500 mg/L，通過公式計(jì)算FIC值為0.375，<0.500，認(rèn)為具有協(xié)同抑制作用。結(jié)果顯示25.000 mg/L NAF與62.50 mg/L EGCG聯(lián)合應(yīng)用能達(dá)到單獨(dú)應(yīng)用100 mg/L NAF或500 mg/L EGCG時(shí)的抑菌效果，NAF與EGCG能夠協(xié)同抑制變異鏈球菌的生長。

2.2 NAF與EGCG對變異鏈球菌生物膜的影響

NAF對變異鏈球菌生物膜的抑制作用，從圖3可以看出NAF能夠顯著抑制變異鏈球菌生物膜的生長，NAF對變異鏈球菌的MBIC值為62.50 mg/L。

n=3；***：P<0.01

EGCG對變異鏈球菌生物膜的抑制作用，從圖4可以看出EGCG能夠抑制變異鏈球菌生物膜的生長，EGCG對變異鏈球菌MBIC值為62.50 mg/L。

n=3；***：P<0.01

NAF與EGCG單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌生物膜的影響，如圖5、6結(jié)果顯示,當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用25.000 mg/L NAF和62.50 mg/L EGCG時(shí)，變異鏈球菌的生物膜形成量與對照組相比顯著減少(P<0.01)，并且與單獨(dú)應(yīng)用25.000 mg/L NAF和62.50 mg/L EGCG時(shí)生物膜的形成量也相對減少(P<0.01)。

n=3；***：P<0.01

2.3 NAF與EGCG單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

如圖7結(jié)果顯示，NAF與EGCG均能抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸活動(dòng)，24 h后25 mg/L NAF產(chǎn)酸抑制率為22.5%，62.50 mg/L EGCG產(chǎn)酸抑制率為35%。NAF與EGGC聯(lián)合應(yīng)用時(shí)25.000 mg/L NAF與62.50 mg/L EGCG混合溶液對變異鏈球菌的產(chǎn)酸抑制率為60%，比單獨(dú)應(yīng)用NAF或EGCG時(shí)產(chǎn)酸抑制率明顯增加(P<0.01)，充分說明兩者聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)對變異鏈球菌產(chǎn)酸的抑制作用。

A：25.000 mg/L NAF+62.50 mg/L EGCG組；B：EGCG(62.50 mg/L)組；C：NAF(25.000 mg/L)組；D：對照組

圖7 NAF與EGCG單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

3 討論

NAF作為一種傳統(tǒng)防齲藥物，在齲病預(yù)防上發(fā)揮著重要作用，但是近年來對氟化物安全性問題進(jìn)行了大量研究討論[13]。研究顯示氟化物如果使用不當(dāng)很容易造成氟中毒、氟牙癥等其他疾病[14-15]，因此提高NAF功效，減少NAF用量顯得尤為重要[16]。通過研究NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用對于變異鏈球菌的影響，尋找一個(gè)更好抑制變異鏈球菌生長繁殖的方法，為預(yù)防齲病提供一個(gè)新的思路[17]。

變異鏈球菌的致齲能力主要為耐酸性、產(chǎn)酸性以及生物膜形成能力，使變異鏈球菌能以生物膜的形式附著在牙齒表面，其糖酵解以及其他反應(yīng)產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物可對牙體硬組織造成損傷，并使變異鏈球菌在菌斑生物膜中保持優(yōu)勢地位[3]。通過對變異鏈球菌的生長，生物膜的形成，以及產(chǎn)酸方面進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG和NAF都能夠顯著抑制變異鏈球菌浮游菌以及生物膜的生長，并明顯抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸反應(yīng)。當(dāng)NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抗菌性能顯著增強(qiáng)，25.000 mg/L NAF與62.50 mg/L EGCG聯(lián)合應(yīng)用就可以達(dá)到單獨(dú)使用100 mg/L NAF以及單獨(dú)使用500 mg/L EGCG時(shí)的抑菌效果。NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用生物膜的形成量比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)生物膜形成量明顯減少并且可以增強(qiáng)對變異鏈球菌產(chǎn)酸的抑制作用。相關(guān)研究顯示變異鏈球菌的耐酸性主要與胍丁胺脫亞氨酶系統(tǒng)(agmatine deiminase system，AgDS)和F-ATP酶有關(guān)，而耐酸性是變異鏈球菌能在酸性環(huán)境中存活以及繁殖的重要特征，EGCG 可以抑制F-ATP酶活性與AgDS的作用，從而造成細(xì)胞質(zhì)酸度增加，抑制細(xì)胞內(nèi)一些不耐酸酶類的正常功能，包括糖酵解反應(yīng)和EPS的生成，進(jìn)而降低了細(xì)菌對酸性環(huán)境的適應(yīng)性[18-20]。氟化鈉以HF的形式進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，解離成H+和F-，還可將F-ATP酶排出的質(zhì)子帶回細(xì)胞質(zhì)，不僅抑制了F-ATP酶的功能還使細(xì)胞質(zhì)酸化，破壞了細(xì)菌的耐酸性，還可以導(dǎo)致細(xì)菌的死亡[21]。EGCG與氟化鈉合用不僅可以破壞變異鏈球菌的耐酸性，還可以通過抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)和唾液淀粉酶的活性來影響碳水化合物的代謝，一方面抑制細(xì)菌的生長和生物膜的形成，另一方面也減少了酸的產(chǎn)生，生物膜形成量的減少也使細(xì)菌繁殖及生長速率減慢，產(chǎn)酸量也可隨之下降[8]。EGCG和氟化鈉還可以通過多種途徑抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸，既可通過上述細(xì)胞質(zhì)酸化影響糖酵解反應(yīng)抑制細(xì)菌產(chǎn)酸，還可以通過抑制乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性[9-10]抑制酸性產(chǎn)物的生成。EGCG和氟化鈉對變異鏈球菌的生長繁殖，生物膜以及產(chǎn)酸的抑制是通過一系列復(fù)雜生物聯(lián)級反應(yīng)造成的，除了上述的抑菌機(jī)制外還可通過其他途徑抑菌。

本研究得出結(jié)論，當(dāng)EGCG和氟化鈉聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以在增強(qiáng)NAF對變異鏈球菌抑制作用的同時(shí)減少NAF用量，并充分發(fā)揮EGCG天然抗齲劑的作用，從而為齲病防治提供一個(gè)新的方法。NAF與EGCG聯(lián)合應(yīng)用既可以通過相同的抑菌途徑共同抑制細(xì)菌毒性，也可以通過不同的方式對細(xì)菌多種毒性因子進(jìn)行抑制，從而達(dá)到比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更好的抑菌效果，但是具體抑制機(jī)制需要我們更加深入的研究。