陳敏純，閆抗抗，曹 青，谷建俐，鄭 潔，劉生元

（西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院 藥劑科，陜西 西安710018）

缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類健康，其致病率、死亡率居全球首位[1]。缺血是缺血性腦卒中損傷的始動因素?！爸委熜匝苄律背蔀閲鴥?nèi)外治療缺血性腦卒中的研究熱點[2]。血管新生為缺血性腦卒中的神經(jīng)發(fā)生、突出再生、神經(jīng)功能恢復(fù)提供氧氣、供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，以及提供生長因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α/Nrf2是挽救腦細胞，恢復(fù)神經(jīng)功能的潛在靶點，PGC-1α/Nrf2通路是參與內(nèi)皮細胞形成血管的關(guān)鍵性靶點，其調(diào)控血管新生所累及多種因子表達[4-5]。臨床以赤芍為主要組成的中藥復(fù)方制劑和中成藥有數(shù)百種（如：補陽還五湯、通竅活血湯、步長腦心通膠囊、腦血栓片等），這些藥物治療缺血性腦卒中應(yīng)用廣泛且療效確切，充分證實赤芍腦保護作用。賈所學(xué)在《藥品化義》中記載“紅花為血中氣藥，能瀉又能補，佐赤芍治遍身血氣刺痛，此其行導(dǎo)而活血也”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明赤芍可改善腦組織線粒體酶活性，緩解腦能量代謝障礙，改善大鼠腦梗死面積，減少神經(jīng)元細胞凋亡[6-7]。赤芍對腦缺血損傷有保護作用，但其改善腦缺血與促進腦血管新生的相關(guān)性及分子作用機制，鮮有報道。本研究以大鼠缺血性腦卒中為模型，考察赤芍調(diào)控PGC-1α/Nrf2信號通路促血管新生作用，為中醫(yī)藥防治缺血性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器、藥品及試劑

Cyto FLEX型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；RM 2016型病理切片機（德國萊卡公司）；BX53型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HI650型冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Multiskan MK3型全自動酶標(biāo)儀（美國賽默飛科技公司）；JY-SCZ2+型電泳儀及170-4070轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio Rad公司）。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（美國Roche Applied Science公司，批號：12156792910）；抗熒光淬滅封片劑（美國Southern Biotech公司，批號：0100-01）；DAPI（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1002）；CD34（美國Abcam公司，批號：ab81289）；PGC-1α抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：66369-1-Ig）；Nrf2抗體（美國Affinity公司，批號：AF0639）；VEGF抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：19003-1-AP）；VEGFR-2抗體（美國Abcam公司，批號：ab45010）；赤芍（陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20191201）。

1.2 動物

8 ～ 10周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為180 ～ 220 g，購于三峽大學(xué)實驗動物中心。大鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后才開始試驗。

2 試驗方法

2.1 分組、給藥、造模

分組：將40只大鼠分為空白對照組、模型組、赤芍低劑量組（200 mg/kg）、赤芍中劑量組（350 mg/kg）、赤芍高劑量組（500 mg/kg），共5組，每組8只。赤芍制劑制備按《標(biāo)準(zhǔn)化煎藥中心基本要求》（SCM02-2018）的制作方法，將赤芍按劑量煎煮制成湯劑，采用噴霧干燥技術(shù)將湯劑制成細顆粒，用生理鹽水溶解灌胃。給藥劑量基于預(yù)實驗和以往文獻數(shù)據(jù)[8]赤芍0.5 g/kg。大鼠缺血性腦卒中模型建立：用尼龍線線栓法制備大鼠大腦右側(cè)頸內(nèi)動脈阻閉模型，在頸正中切開小口，結(jié)扎頸總動脈和頸內(nèi)外動脈，在頸總動脈分叉下方剪開小口，置入線栓。缺血2 h后拔除線栓?？瞻讓φ战M和模型組給予生理鹽水灌胃，給藥組每天給予赤芍一次，連續(xù)灌胃7 d。

2.2 神經(jīng)功能評分

給藥結(jié)束后，進行Garcia評分，根據(jù)自主運動情況，碰觸胡須反應(yīng)情況，大鼠懸空狀態(tài)時四肢活動對稱情況，大鼠攀爬能力及抓握鐵網(wǎng)能力，前爪伸展情況，碰觸大鼠身體其感覺反應(yīng)情況等，按照大鼠反應(yīng)程度進行1、2、3分評定，分數(shù)越高，意味著大鼠神經(jīng)功能越完善。

2.3 腦梗死體積檢測

大鼠神經(jīng)功能評分后，用水合氯醛（100 mg/kg）進行腹腔注射，取大腦，沿冠狀面進行切片，約2 mm厚度，浸泡于2% TTC溶液中，孵育30 min后用10%的多聚甲醛固定2 h，呈現(xiàn)紅色為非梗死區(qū)域，呈現(xiàn)白色為梗死區(qū)域。計算腦梗死體積。

2.4 腦組織病理學(xué)觀察

大鼠腦組織塊用10%的多聚甲醛固定2 h后，用不同濃度的乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片處理，用蘇木精堿性染料將細胞核染成藍紫色，1%伊紅酸性染液將細胞質(zhì)染成紅色。照相倍數(shù)為200倍。

2.5 TUNEL凋亡檢測

大鼠腦組織切片用二甲苯、乙醇、PBS進行預(yù)處理，滴加蛋白酶K工作液反應(yīng)30 min，目的是去除組織蛋白。然后加入2% H2O2孵育5 min，用PBS洗滌3次，滴加TdT酶反應(yīng)混合液，于37 ℃中避光孵育1 h，再對標(biāo)本進行染核，滴加DAPI避光孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察組織切片，呈紅色熒光為凋亡細胞，呈藍色熒光為細胞核。照相倍數(shù)為400倍。

2.6 大鼠腦微血管密度

將大鼠腦組織石蠟切片進行脫蠟，抗原修復(fù)10 min，加入3% H2O2溶液孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶，再滴加1∶400 CD34溶液孵育15 h，PBS清洗3次，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗，于37 ℃中孵育20 min后，加入顯色劑顯色，用蘇木素復(fù)染1 min后脫水封片。照相倍數(shù)為400倍。

2.7 腦 組 織 中PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達檢測

提取腦組織蛋白并對蛋白濃度進行定量計算。配制電泳膠，用移液槍將制備好的蛋白樣品和MAKER滴加到電泳膠上，各分析樣品總蛋白量為40 μg，在恒壓120 V下進行電泳分離后，取出凝膠并切下目的條帶，進行轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，在室溫環(huán)境中的搖床儀器上封閉2 h。將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中（一抗稀釋液比例PGC-1α為1∶2 000、Nrf2為1∶500、VEGF為1∶500、VEGFR-2為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再次將PVDF膜浸泡于HRP標(biāo)記二抗的孵育液中，37℃搖床孵育2 h。顯色曝光，用BandScan分析膠片灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評分

空白對照組大鼠神經(jīng)功能正常，模型組神經(jīng)功能受損最嚴(yán)重。與空白對照組比較，模型組評分降低（P< 0.05），表明模型制備成功。給藥組神經(jīng)功能明顯改善，與模型組比較，赤芍低、中、高劑量組評分均降低（P< 0.05），且呈劑量依賴性，見表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能評分±s，n = 8）Tab. 1 Effects of paeoniae on neurological sore in model rats±s，n = 8）

表1 大鼠神經(jīng)功能評分±s，n = 8）Tab. 1 Effects of paeoniae on neurological sore in model rats±s，n = 8）

注：與空白對照組比較，＃P < 0.05；與模型組比較，*P < 0.05。

組別 神經(jīng)功能評分空白對照組 18.00 ± 0.00模型組 6.12 ± 0.35＃赤芍低劑量組 7.75 ± 0.36*赤芍中劑量組 9.75 ± 0.53*赤芍高劑量組 11.50 ± 0.46*F 141.149 P 0.000

3.2 腦梗死體積

空白對照組大鼠腦組織形態(tài)正常，無梗死體積，模型組大腦梗死體積最大（37.38 ±1.62）%，而給藥組腦梗死體積與模型組比較，梗死體積變?。≒<0.05），且呈劑量依賴性，高劑量組腦梗死灶最?。?2.26 ± 0.65）%。說明赤芍改善缺血性腦卒中大鼠腦神經(jīng)功能，縮小腦梗死灶，見圖1。

圖1 大鼠腦梗死體積（n = 8）Fig.1 Effects of paeoniae on cerebral infarct volume in model rats（ n = 8）

3.3 腦組織病理學(xué)變化

HE染色顯示空白對照組神經(jīng)元細胞數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)基本正常，胞核位于細胞中央；模型組腦組織疏松，神經(jīng)元細胞排列紊亂，胞核固縮，顏色深染。給藥組的腦組織形態(tài)明顯恢復(fù)，胞核固縮較模型組程度低，神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失但大體形態(tài)存在。證實給藥組腦組織病理學(xué)改善明顯，赤芍對缺血性腦卒中大鼠有治療作用，見圖2。

圖2 大鼠腦組織病理學(xué)變化（×200）Fig.2 Effects of paeoniae on the pathological changes in the brain tissue of model rats（ ×200）

3.4 TUNEL檢測細胞凋亡情況

空白對照組無TUNEL陽性細胞，而模型組細胞凋亡數(shù)量最多（47.58 ± 3.51）%。與模型組比較，給藥組TUNEL陽性細胞降低（P< 0.05），且呈劑量依賴型，高劑量組細胞凋亡數(shù)最少（29.32 ± 2.65）%，見圖3。

圖3 赤芍對模型大鼠抗細胞凋亡影響（n = 8）Fig.3 Effects of paeoniae on anti-apoptosis in model rats（n = 8）

3.5 大鼠腦血管新生的影響

空白對照組大鼠腦組織血管豐富，與空白對照組比較，模型組CD34表達降低，新生血管減少（P<0.05）；與模型組比較，給藥組CD34表達水平明顯升高（P< 0.05），且呈劑量依賴型，見圖4。

圖4 赤芍對模型大鼠腦組織血管新生的影響（×400）Fig.4 Effects of paeoniae on angiogenesis in the brain tissue of model rats（×400）

3.6 腦 組 織 中PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達蛋白表達影響

與空白對照組比較，模型組PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達增加（P< 0.05）；與模型組比較，給藥組PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達明顯增加（P< 0.05），見圖5。

圖5 赤芍對模型大鼠PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表達影響（n = 8）Fig.5 Effects of paeoniae on the expression of PGC-1α，Nrf2，VEGF and VEGFR-2 in the brain tissue of model rats（n = 8）

4 討論

“治療性血管新生”與中醫(yī)學(xué)的“益氣生脈”“活血生肌”理論密切相關(guān)。缺血性腦卒中可歸為中醫(yī)血瘀證“血脈瘀阻”，而“活血生肌”是中醫(yī)治療腦缺血的主要治法。赤芍有破血行氣、清熱解毒、引血下行之功效。通過對中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的用藥規(guī)律統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，單味中藥用藥頻次赤芍位居第六[9]。辨證為氣虛血瘀證、痰濕阻絡(luò)證、風(fēng)痰痹阻證、顱腦水瘀證中，赤芍使用頻率分別為52.01%、48.43%、45.93%、32.65%[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)赤芍改善腦缺血梗死面積，增加SOD、CAT和GSH-Px活性，降低血清MDA和LPO水平；上調(diào)Bax水平和下調(diào)Bcl-2水平，發(fā)揮抗凋亡損傷[11]。前期研究證實赤芍中的多酚類活性物質(zhì)鞣花酸具有血管內(nèi)皮保護作用，且發(fā)現(xiàn)對Nrf2有誘導(dǎo)作用[12]。因而推測，赤芍可激活Nrf2信號通路促進血管新生，發(fā)揮腦保護作用。

本研究顯示赤芍縮小腦組織梗死灶，緩解病理損傷，減少神經(jīng)元細胞凋亡，對缺血性腦卒中大鼠有保護作用。赤芍是否通過促血管新生發(fā)揮腦保護作用，需進一步進行缺血灶微血管密度及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達水平的檢測。免疫組化結(jié)果顯示空白對照組CD34僅有少量黃褐色沉淀。與空白對照組比較，模型組CD34表達上升。CD34蛋白是新生血管增殖的標(biāo)志物，在正常情況下為少量表達，腦缺血后，CD34表達增多，則提示腦缺血刺激CD34表達，促血管新生。給藥組高于模型組（P< 0.05），表明赤芍上調(diào)CD34表達，增加大鼠缺血灶微血管密度。VEGF是一種內(nèi)源性血管生長因子，在血管生成的各個階段均發(fā)揮著重要作用[13]。VEGFR-2是VEGF的受體，作用于血管內(nèi)皮細胞，兩者結(jié)合激活血管新生效應(yīng)。本實驗顯示，與模型組比較，給藥組增加腦組織VEGF、VEGFR-2表達，提示赤芍上調(diào)VEGF、VEGFR-2等細胞因子表達，增加缺血周圍組織的微血管密度，促進缺血區(qū)域循環(huán)的建立。

PGC-1α是調(diào)控內(nèi)皮細胞凋亡的重要因子，動員VEGF參與新生血管形成，改善神經(jīng)和內(nèi)皮損傷[14]。Nrf2是維持內(nèi)皮細胞的形態(tài)和保持血管功能完整性的重要因子[15]?，F(xiàn)代研究表明，Nrf2激活可促進血管內(nèi)皮細胞的出芽生長，增加深層毛細血管數(shù)量，在血管新生過程中發(fā)揮效應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組PGC-1α表達增加（P< 0.05）。此結(jié)果與以往研究結(jié)果一致，研究證明PGC-1α有神經(jīng)保護作用[16]，腦缺血損傷則上調(diào)PGC-1α表達，而抑制PGC-1α表達則加重腦損傷。與模型組比較，給藥組PGC-1α、Nrf2蛋白表達顯著上調(diào)，提示赤芍促血管新生作用通過激活PGC-1α/Nrf2信號通路誘導(dǎo)VEGF/VEGFR-2高表達。

5 結(jié)論

本實驗研究了赤芍激活PGC-1α/Nrf2信號通路促血管新生發(fā)揮腦保護作用，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。同時，闡明赤芍“活血生肌”抗缺血性腦卒中的科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中提供一定的試驗依據(jù)。本實驗尚需應(yīng)用PGC-1α-/-或Nrf2-/-模式動物，驗證PGC-1α與Nrf2和VEGF的關(guān)系及促血管新生的作用。