金晶玉朱成杰權(quán)英實黃學洙

(1.延邊大學附屬醫(yī)院麻醉科,吉林 延吉 133002;2.延邊大學附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護科,吉林 延吉 133002)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種常見消化道腫瘤,可能與結(jié)腸炎癥進展、飲食習慣、遺傳等多種因素有關(guān),發(fā)病率和死亡率較高[1]。CRC早期一般無特異性癥狀,就診時大多已發(fā)展至腫瘤的中晚期,常規(guī)的手術(shù)切除治療難以清除病灶組織,術(shù)后需要輔以放化療來降低復發(fā)風險[2-3]。但長期大量使用化療藥物會殺傷機體正常細胞,引起骨髓抑制、肝腎毒性等,影響化療效果[4]。尋找一種輔助治療CRC的藥物來抑制腫瘤的增殖促進其凋亡尤為重要。羅哌卡因是一類酰胺類的新型局部麻醉藥,具有對心臟毒性小、麻醉時間長等優(yōu)點[5]。Qin等[6]研究表明,羅哌卡因可以抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、侵襲及遷移,并促進其凋亡。高聰?shù)萚7]研究表明:羅哌卡因可以有效抑制結(jié)腸癌細胞增殖,但關(guān)于羅哌卡因誘導人結(jié)直腸SW620細胞株凋亡的機制研究尚不明確。因此本研究選擇從線粒體通路途徑探究羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸SW620細胞株凋亡的作用及可能的機制,旨在為CRC患者治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞

結(jié)直腸SW620細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

青霉素和鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyelone公司);Bcl-2抗體(貨號:ab32124;批號:190807)、Bax抗體(貨號:ab32503;批號:191011)、Caspase-3抗體(貨號:ab13847;批號:190701)、Caspase-3抗體(貨號:ab32539;批號:190904)購自美國Abcam公司。離心機(型號:TGL-16M,濟南來寶醫(yī)療器械有限公司);流式細胞儀(型號:CytoFLE,美國貝克曼有限公司);細顯微鏡(型號:WMS-1037)購自上海無陌光學儀器有限公司;細胞培養(yǎng)箱(型號:ZSP-350S,上海左樂儀器有限公司);蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀及相關(guān)系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將凍存的結(jié)直腸SW620細胞株接種于含質(zhì)量分數(shù)為10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于溫度為37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,當細胞生長融合至80%左右,加入胰蛋白酶進行消化,傳代培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8檢測細胞活性

當細胞在細胞培養(yǎng)箱中生長匯合率達到80%時將細胞傳代接種至24孔板中(每孔100 μL),使用不同濃度的羅哌卡因處理(1、5、10、20、50、100、200、400、800 μg/mL)放入溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁后,分別培養(yǎng)0、1、2、3 d后加10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)2 h后使用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度值,計算結(jié)直腸SW620細胞的增長率。抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞膜電位及細胞周期和凋亡情況

取與相應藥物孵育至對數(shù)生長期的結(jié)直腸SW620細胞接種于24孔板內(nèi),采用PBS調(diào)整細胞濃度至每毫升6×105個,培養(yǎng)48 h后收集細胞,一部分放入流式細胞樣管中,使用離心機在2000 r/min的條件下離心5 min,棄上清,加入濃度為5 μg/mL的Rhodamine 200 μL避光孵育30 min,使用流式細胞儀分析結(jié)直腸SW620細胞的膜電位情況。另一部分加入200 μL質(zhì)量分數(shù)為50 ng/L的PI和質(zhì)量分數(shù)為20 ng/L的Nase A染液,在溫度為4℃避光條件下,共同孵育30 min,上用流式細胞儀分析結(jié)直腸SW620細胞周期及凋亡率情況。

1.3.4 Western blot檢測結(jié)直腸SW620細胞蛋白表達水平

取與相應藥物孵育至對數(shù)生長期的結(jié)直腸SW620細胞,離心(4℃,10 min),采用裂解液裂解后提取總蛋白。依次進行電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜,加入質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9抗體(稀釋比例均為1∶500),溫度為4℃條件下孵育過夜,加入二抗,常規(guī)孵育2 h,計算各蛋白相對內(nèi)參蛋白為GADPH的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用軟件為GraphPad Prism5軟件作圖,采用軟件為SPSS 22.0軟件分析所有試驗數(shù)據(jù),多組間比較使用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測癌細胞活力結(jié)果

使用CCK-8實驗檢測使用不同濃度羅哌卡因處理后發(fā)現(xiàn),當使用羅哌卡因濃度為10 μg/mL時,對結(jié)腸癌細胞的抑制率約為(92.01±4.00)%顯著低于使用哌卡因濃度為1 μg/mL時的抑制率(99.00±0.01)%;隨著使用羅哌卡因濃度增加,結(jié)腸癌細胞的抑制率逐漸降低(P<0.05),依據(jù)本實驗檢測結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌SW620細胞的半數(shù)致死濃度約為69.36 μg/mL,見圖1。

圖1 CCK-8檢測癌細胞活力結(jié)果(n=24)Figure 1 Viability of cancer cells detected by CCK-8

2.2 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞線粒體膜電位影響

檢測各組細胞線粒體膜電位發(fā)現(xiàn),相比結(jié)直腸癌SW620細胞,低劑量羅哌卡因組細胞膜電位顯著降低(P<0.01);相比低劑量羅哌卡因組,中劑量羅哌卡因組細胞膜電位顯著降低(P<0.01);相比中劑量羅哌卡因組,高劑量羅哌卡因組細胞膜電位顯著降低(P<0.01),見圖2。

2.3 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞周期及凋亡影響

檢測羅哌卡因?qū)Ω鹘M人結(jié)直腸癌SW620細胞周期及凋亡影響發(fā)現(xiàn),相比結(jié)直腸癌細胞組,低劑量羅哌卡因組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低(P<0.01);相比低劑量羅哌卡因組,中劑量羅哌卡因組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低(P<0.01);相比中劑量羅哌卡因組,高劑量羅哌卡因組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞周期及凋亡影響(ˉx±s,n=24)Table 1 Effects of ropivacaine on the cycle and apoptosis of human CRC cells

2.4 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞凋亡蛋白表達影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞凋亡蛋白發(fā)現(xiàn),相比結(jié)直腸癌細胞組,低劑量羅哌卡因組Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達顯著升高,Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01);相比低劑量羅哌卡因組,中劑量羅哌卡因組Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達顯著升高,Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01);相比中劑量羅哌卡因組,高劑量羅哌卡因組Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達顯著升高,Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01),見圖3和表2。

表2 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞凋亡蛋白相對表達量影響(ˉx±s,n=24)Table 2 Effects of ropivacaine on the relative expression levels of apoptosis proteins in human CRC cells

注:與結(jié)直腸癌細胞組相比,??P<0.01;與低劑量羅哌卡因組相比,##P<0.01;與中劑量羅哌卡因組相比,&&P<0.01。圖2 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞線粒體膜電位影響(n=24)Note.Compared with colorectal cancer cell group,??P<0.01.Compared with low-dose ropivacaine group,##P<0.01.Compared with medium-dose ropivacaine group,&&P<0.01.Figure 2 Effects of ropivacaine on MMP in human CRC cells

注:A:結(jié)直腸癌細胞組;B:低劑量羅哌卡因組;C:中劑量羅哌卡因組;D:高劑量羅哌卡因組。圖3 羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW620細胞凋亡蛋白表達影響(n=24)Note.A,CRC cell group.B,Low-dose ropivacaine group.C,Medium-dose ropivacaine group.D,High-dose ropivacaine group.Figure 3 Effects of ropivacaine on the expression of apoptosis proteins in human CRC cells

3 討論

細胞凋亡是指由基因調(diào)控的細胞自主性的程序性死亡,細胞主要通過細胞的凋亡調(diào)控內(nèi)環(huán)境[8]。目前研究表明,細胞凋亡主要有3種途徑:Bcl-2/Bax介導的線粒體細胞凋亡通路、死亡受體途徑介導的細胞凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[9]。其中線粒體通路是目前研究的凋亡通路中最經(jīng)典的凋亡通路。Baechler等[10]研究表明:線粒體通路途徑可通過改變線粒體膜通透性,引起細胞膜內(nèi)外Ca2+平衡被打破,使得細胞膜內(nèi)外出現(xiàn)電位差,當線粒體膜電位降低會導致線粒體呼吸(電子傳遞)加速,氧自由基生成增加,發(fā)生氧化應激反應使得細胞凋亡。因此本研究檢測了各組膜內(nèi)外電位變化,發(fā)現(xiàn)相比結(jié)直腸癌細胞組,使用羅哌卡因各組細胞膜電位顯著降低。說明使用羅哌卡因可以改變線粒體膜通透性,導致膜內(nèi)外Ca2+平衡被打破,降低細胞膜內(nèi)電位,促進氧化應激反應誘導細胞凋亡。

線粒體通路途徑誘導細胞凋亡除了通過改變粒體膜通透性引起膜電位差外,還可以通過活化Caspase等蛋白酶家族,誘導凋亡相關(guān)因子的釋放等,引起細胞凋亡的級聯(lián)反應,最終導致細胞凋亡[11]。目前研究較多的細胞凋亡相關(guān)蛋白家族主要包括Caspase家族和Bcl-2家族。Caspase家族中Caspase-3是常見的啟動子,Caspase-9是常見的執(zhí)行子[12]。當細胞接收到凋亡信號后會激活Caspase-3,促進Caspase-9自身裂解產(chǎn)生pro-Caspase-9,并反過來再次活化Caspase-3引發(fā)細胞凋亡的級聯(lián)反應[13]。除了Caspase家族,在Bcl-2家族中主要包括促凋亡基因Bcl-2和抑凋亡基因Bax[14]。本研究通過蛋白質(zhì)印跡實驗發(fā)現(xiàn),相比結(jié)直腸癌細胞組,使用羅哌卡因處理各組結(jié)直腸癌SW620細胞中Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白相對表達水平升高,Bax蛋白表達下降。說明羅哌卡因處理可以激活Caspase家族中的凋啟動子并促進Bcl-2家族中的促凋亡基因的表達。王文婷等[15]研究表明:羅哌卡因作用結(jié)直腸癌SW620細胞后可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達,誘導腫瘤細胞凋亡,本研究得出的結(jié)論與其相一致。

細胞周期可分為4個時相:G1、S、G2、M。其中G1期是DNA合前期,主要合成RNA和核糖體;G2期是DNA合成后期,主要是RNA和蛋白質(zhì)的合成;M期是細胞裂期,所有細胞執(zhí)行定物功能;S期是分裂期[16]。在細胞周期中每一個誤差都可能導致遺傳信息的改變[17]。本研究通過檢測細胞周期發(fā)現(xiàn),相比結(jié)直腸癌細胞,使用羅哌卡因各組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低。姬寧寧等[18]研究表明:羅哌卡因可以通過阻滯細胞周期,抑制癌細胞的增殖。研究結(jié)果說明使用羅哌卡因可以有效將SW620細胞阻滯與G0/G1期,這可能是因為用羅哌卡因?qū)⒆铚私Y(jié)直腸癌SW620細胞合成RNA和核糖體并使得細胞分裂所需的必要蛋白合成受阻導致癌細胞的增殖受到抑制。

綜上所述,羅哌卡因可以通過線粒體途徑促進人結(jié)直腸SW620細胞的凋亡,其作用機制可能與Caspase-3及Bcl-2信號傳導相關(guān)。