劉丹丹，徐國(guó)彤，張敬法

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR，簡(jiǎn)稱(chēng)糖網(wǎng)病)是糖尿病在眼部的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。在我國(guó)糖尿病人群中DR患病率為23%。隨著糖尿病患者病程的延長(zhǎng)，DR患病率逐年提高，致盲率也逐年上升。因此，及早發(fā)現(xiàn)及控制糖尿病，及時(shí)診治DR，降低致盲率，減輕家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)，已成為亟待解決的問(wèn)題之一[1]。隨著臨床和基礎(chǔ)研究的不斷深入，DR不再是傳統(tǒng)意義上單純的微血管并發(fā)癥，而是糖尿病繼發(fā)的全視網(wǎng)膜并發(fā)癥，累及視網(wǎng)膜內(nèi)各類(lèi)細(xì)胞，包括神經(jīng)元(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞和光感受器細(xì)胞)、血管組成細(xì)胞(周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)、膠質(zhì)細(xì)胞(Müller細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)以及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞[2]。當(dāng)前對(duì)DR發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)聚焦為微血管病變、神經(jīng)元病變以及中低度的炎癥反應(yīng)。本文旨在探討促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對(duì)DR的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為EPO干預(yù)治療早期DR及視網(wǎng)膜退行性疾病提供新的方向。

1促紅細(xì)胞生成素及其在眼內(nèi)的作用

EPO是一種糖蛋白激素，在體內(nèi)具有抑制骨髓中紅系祖細(xì)胞的凋亡并誘導(dǎo)其分化成熟為紅細(xì)胞。胎兒發(fā)育期間，EPO主要在肝臟產(chǎn)生，成人后腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞成為產(chǎn)生EPO的主要來(lái)源，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式經(jīng)血流到達(dá)骨髓，刺激造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化。然而，成人循環(huán)中大約10% EPO來(lái)自腎臟以外的組織，如大腦、視網(wǎng)膜、脾臟、肺、胎盤(pán)、子宮和睪丸[3]。隨著EPO及其受體(EPOR)在視網(wǎng)膜中的發(fā)現(xiàn)及其在DR中作用研究的深入。EPO對(duì)維持視網(wǎng)膜正常生理功能及在病理狀態(tài)下均具有重要作用。

EPO在人出生前對(duì)視覺(jué)發(fā)育至關(guān)重要。早在2008年，美國(guó)猶他大學(xué)的Shrena Patel研究發(fā)現(xiàn)胎兒玻璃體及血清中EPO含量隨胎齡增加而增加，且玻璃體中EPO濃度顯著較血清高[4]。在成人視網(wǎng)膜中，EPO表達(dá)調(diào)控主要基于組織中氧飽和度的反饋機(jī)制，即通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)來(lái)調(diào)控。在缺氧條件下，HIF-1α表達(dá)增加、蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)并與HIF-1β形成二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，誘導(dǎo)下游多種基因的轉(zhuǎn)錄[如EPO、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)]，影響視網(wǎng)膜功能[5]。

近年來(lái)，EPO在DR中的作用也相繼被挖掘。研究表明，在患有慢性腎功能衰竭的非糖尿病患者中，EPO治療可顯著增加低血糖發(fā)生率，提示EPO可能對(duì)胰腺β細(xì)胞有直接作用[6]。加拿大多倫多大學(xué)Diana Choi團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，重組人EPO(rhEPO)可通過(guò)結(jié)合胰腺β細(xì)胞內(nèi)EPOR激活下游JAK2激酶信號(hào)通路，最終增加β細(xì)胞數(shù)量，降低血糖水平[7]。除EPO全身作用外，我們團(tuán)隊(duì)在臨床個(gè)案研究中發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔內(nèi)注射EPO可提高難治性、彌漫性糖尿病黃斑水腫患者的視力，并顯著減輕黃斑水腫[8]，表明眼內(nèi)注射EPO對(duì)視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用,該保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)負(fù)反饋抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路，從而降低VEGF的表達(dá)與分泌[9]。隨著EPO治療DR的研究進(jìn)展，其抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抗炎、抗氧化等作用被相繼報(bào)道。

2 EPO在DR中的抗凋亡作用

神經(jīng)元凋亡是包括DR在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的“終末共同途徑”[10]。在DR早期，視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生退行性病變，主要以神經(jīng)元凋亡(neuronal apoptosis)和膠質(zhì)反應(yīng)(reactive gliosis)為主要特征。研究表明EPO治療可減少早期DR動(dòng)物模型中視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡。外源EPO可與視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞上EPOR結(jié)合，并激活JAK2激酶及其下游多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和PI3K/Akt等信號(hào)通路，抑制促凋亡基因(如Bax和Bak)的表達(dá)并促進(jìn)抗凋亡基因(如Bcl-xL和Bcl-2)的表達(dá)，從而抑制內(nèi)在死亡途徑實(shí)現(xiàn)抗神經(jīng)元凋亡作用[11](圖1)。

圖1 DR中，EPO的神經(jīng)保護(hù)、抗凋亡和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用 ↑表示促進(jìn)；表示抑制。

HIF-1α是EPO蛋白表達(dá)的主要調(diào)控因子，低氧條件下HIF-1α的過(guò)表達(dá)抑制了p53的泛素化和降解，維持了p53的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。在糖尿病大鼠模型中，玻璃體腔注射外源EPO通過(guò)負(fù)反饋抑制其上游轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達(dá)[9]，這可能是EPO抑制神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制之一。

3 EPO在DR中的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用

EPO在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用[14-15]。我們課題組在過(guò)去幾年中率先開(kāi)展了在鏈脲菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠眼內(nèi)注射EPO的療效觀察，研究發(fā)現(xiàn)：玻璃體腔內(nèi)注射EPO能有效保護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)多種類(lèi)型細(xì)胞(如各類(lèi)神經(jīng)元、血管組成細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、RPE細(xì)胞等)防止糖尿病損傷，為EPO干預(yù)治療早期DR提供了理論依據(jù)。在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用方面，外源性EPO可通過(guò)與糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Müller細(xì)胞胞膜上的EPOR結(jié)合激活胞內(nèi)ERK和Akt信號(hào)通路，刺激腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)表達(dá)，減輕Müller細(xì)胞的反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生[16]。

谷氨酸是視網(wǎng)膜中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸水平大量升高導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性毒性增加，從而促使糖尿病狀態(tài)下神經(jīng)元的死亡。EPO可通過(guò)調(diào)節(jié)谷氨酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，如上調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate-aspartate transporter,GLAST)的表達(dá)，從而維持正常的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)；EPO可下調(diào)谷氨酸受體，減輕神經(jīng)元過(guò)度興奮和神經(jīng)元毒性[17]。此外，視網(wǎng)膜內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]的激活也與DR的進(jìn)展有關(guān)，EPO可抑制視網(wǎng)膜內(nèi)聚ADP-核糖聚合物[PAR,poly (ADP-ribose)]的形成并降低核凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)水平，維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[18]。

4 EPO對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用

糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)以及增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)是導(dǎo)致DR患者視力損傷或致盲最常見(jiàn)的并發(fā)癥。目前隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步及早期篩查、防治力度的加大，PDR發(fā)病率不斷降低。當(dāng)前，DME成為DR患者最主要的致盲原因。DME發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的破壞是主要原因。在前期臨床研究中，玻璃體腔注射EPO對(duì)難治性、彌漫性DME患者治療有效，能顯著消退黃斑水腫并提升視力[8]，表明EPO具有保護(hù)和維持BRB的作用。

4.1EPO對(duì)血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的保護(hù)作用血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(inner BRB,iBRB)主要由視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等組成，內(nèi)皮細(xì)胞間所形成的緊密連接是組成iBRB的分子基礎(chǔ)。在DR進(jìn)展過(guò)程中，視網(wǎng)膜內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞發(fā)生丟失和凋亡、緊密連接蛋白表達(dá)減少或分布異常、星形膠質(zhì)細(xì)胞退行性改變、Müller細(xì)胞增生、小膠質(zhì)細(xì)胞活化及各種炎性因子表達(dá)增加[19]，導(dǎo)致iBRB破壞、滲漏增加。玻璃體腔注射EPO可防止糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞凋亡、降低視網(wǎng)膜微血管通透性，維持iBRB完整性[20-21]。在作用機(jī)制上，EPO通過(guò)抑制VEGF/VEGFR2/Src通路減少內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接分子VE-cadherin的磷酸化和內(nèi)化，從而維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能[20]。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，EPO可通過(guò)調(diào)節(jié)Src/Akt/cofilin信號(hào)通路抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和吞噬作用進(jìn)而保護(hù)視網(wǎng)膜微血管完整性[22]。此外，EPO的抗炎作用在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)及乙二醛處理的Müller細(xì)胞模型中也得到了驗(yàn)證[23]。EPO亦可通過(guò)維持視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8(zinc transporter 8,ZnT8)水平調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鋅離子水平，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[24]。以上研究均提示EPO對(duì)iBRB具有保護(hù)作用，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

4.2EPO對(duì)血-視網(wǎng)膜外屏障的保護(hù)作用血-視網(wǎng)膜外屏障(outer BRB,oBRB)主要由RPE細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，是維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)及視覺(jué)生理狀態(tài)的重要基礎(chǔ)。大量有關(guān)DR臨床和基礎(chǔ)研究都觀察到oBRB的破壞以及RPE功能失常，包括早期細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間連接破壞、RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降、生長(zhǎng)因子或炎性因子表達(dá)異常等[25]。

糖尿病大鼠玻璃體腔注射EPO可通過(guò)下調(diào)RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體(RPE-Bruch’s membrane choriocapillaris complex,RBCC)中HIF-1α和JNK信號(hào)通路，從而上調(diào)RPE細(xì)胞中緊密連接蛋白，如ZO-1和occludin的表達(dá)，維持oBRB完整性。體外乙二醛誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞模型驗(yàn)證了上述保護(hù)作用[26]。在高糖+IL-1β誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞模型中，EPO可通過(guò)激活下游的JAK2和PI3K/Akt信號(hào)通路，增加RPE細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，抑制高糖和IL-1β對(duì)oBRB功能的破壞[27]。

以上研究均表明EPO通過(guò)多條信號(hào)通路和途徑發(fā)揮了對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用，從而維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)(圖2)。

圖2 DR中EPO通過(guò)多條信號(hào)通路和途徑發(fā)揮其對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用。

5 EPO對(duì)視網(wǎng)膜退行性病變及其他眼病的保護(hù)作用

EPO具有的抗凋亡特性及神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用使其成為治療視網(wǎng)膜退行性疾病(如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、青光眼等)的理想藥物。PDR和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變具有相似病因病理特征和發(fā)病過(guò)程。在疾病的早期階段，視網(wǎng)膜內(nèi)HIF-1α被抑制或降解，EPO表達(dá)降低，此時(shí)外源給予EPO可通過(guò)上述多條途徑發(fā)揮保護(hù)作用以維持BRB完整性和神經(jīng)元的正常生理功能。然而，在增殖性視網(wǎng)膜病變晚期，視網(wǎng)膜的嚴(yán)重缺氧導(dǎo)致HIF-1α大量表達(dá)，從而觸發(fā)大量新生血管形成，此時(shí)，EPO治療具有促進(jìn)病理性新生血管形成的作用[28]。因此，增殖性疾病早期給予EPO可能是預(yù)防及控制病變進(jìn)展的有效治療方法，而疾病晚期則需要抑制EPO。

對(duì)于其他多種視網(wǎng)膜退行性疾病如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性及青光眼等，由于EPO具有抗凋亡和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等作用，眼內(nèi)注射可以阻止這些退行性眼病共同的晚期階段(終末共同途徑)，即細(xì)胞死亡，也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

6討論與展望

糖尿病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)的公共性疾病，DR作為糖尿病眼部并發(fā)癥，對(duì)糖尿病患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生巨大影響，加重患者及其家庭的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。DR進(jìn)展累及視網(wǎng)膜內(nèi)幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞，例如導(dǎo)致周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、星形膠質(zhì)細(xì)胞退化、Müller細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞活化、視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡、RPE變性等。本文主要就EPO治療DR可能的作用機(jī)制進(jìn)行了綜述，探討了EPO的神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抗炎、抗凋亡及保護(hù)BRB功能的作用，使得EPO或EPOR激動(dòng)劑成為未來(lái)治療DR的潛在藥物。但EPO具有的促紅細(xì)胞生成作用也使其在PDR中的應(yīng)用受到較大爭(zhēng)議[29]。研究表明，EPO可通過(guò)與不同形式的受體結(jié)合發(fā)揮不同功能：如結(jié)合同源二聚體(EPOR/EPOR)發(fā)揮促紅細(xì)胞生成作用，而結(jié)合異源二聚體(EPOR/βCR)發(fā)揮非促紅細(xì)胞生成作用，即神經(jīng)保護(hù)作用等[30]。因此，選擇性靶向異源二聚體的新藥物研發(fā)，如具有非促紅細(xì)胞生成作用的EPO衍生肽有望成為后續(xù)預(yù)防及治療DR強(qiáng)有力的潛在藥物。另外，EPO/EPOR軸在其他多種神經(jīng)退行性疾病中也被廣泛研究，如阿爾茨海默癥、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓損傷等，EPO具有的抗氧化應(yīng)激、抗凋亡及抑制繼發(fā)性神經(jīng)炎癥過(guò)程的作用使其在神經(jīng)退行性疾病治療方面具有廣闊的前景。