程 燕，吳 潔，朱海峰，惠 玲，郝 咪

0引言

角膜病是我國主要致盲眼病之一，其中角膜盲占盲人總數(shù)的1/4，而感染性角膜炎是角膜盲的主要原因[1-2]。發(fā)展中國家每年由角膜感染引起的單眼盲患者約150萬例，主要病原體包括細(xì)菌、真菌、病毒和棘阿米巴原蟲[3]。角膜移植仍然是治療感染性角膜炎的最有效的方法，能夠治愈80%以上的角膜炎患者。近年來，因為同種異體角膜供體的缺乏，所以豬來源的生物角膜因在去細(xì)胞和去抗原處理后可降低其免疫原性并保留角膜的三維立體結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性而應(yīng)用于臨床，解決了部分角膜供體來源缺乏的窘境。然而生物角膜作為異種材料在移植到人眼后是否有免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，免疫排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)和病理機制等一系列問題目前較少報道。本研究在此方面進(jìn)行了探索，對生物工程角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)、體征、激光共焦顯微鏡及免疫組織化學(xué)染色等方面進(jìn)行了一系列的觀察，對生物工程角膜移植排斥發(fā)生機制進(jìn)行初步的探究，為進(jìn)一步的臨床治療提供依據(jù)。

1對象和方法

1.1對象采用回顧性系列病例觀察研究，收集2018-09/2019-12在西安市第一醫(yī)院就診并確診為感染性角膜炎患者180例180眼中術(shù)后發(fā)生免疫排斥患者5例5眼。納入標(biāo)準(zhǔn):(1) 診斷為感染性角膜炎患者，行生物工程角膜移植手術(shù)并發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Holland評分(表1)[4]方法，以角膜混濁、水腫、新生血管3項評分之和定義為角膜免疫排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection index，RI)，當(dāng)RI≥6時即認(rèn)為發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。(2)術(shù)前接受規(guī)范的抗免疫排斥治療病情無明顯好轉(zhuǎn)者。(3)角膜植片嚴(yán)重混濁或者基質(zhì)溶解，須行同種異體角膜移植。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往原發(fā)及繼發(fā)干燥綜合征、糖尿病及其他自身免疫性疾病。(2)上皮型、基質(zhì)型及內(nèi)皮型等各型病毒性角膜炎。(3)對側(cè)眼有角膜炎、青光眼、高度近視等眼部疾病者。本試驗通過西安市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和國家食品藥品監(jiān)督局(國家藥品監(jiān)督管理局)醫(yī)療器械技術(shù)審評中心備案，患者入組前均簽署知情同意書。

表1 角膜移植各項觀察指標(biāo)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2方法

1.2.1手術(shù)步驟手術(shù)均由同一位經(jīng)驗豐富的醫(yī)師完成。術(shù)眼使用2%的布比卡因和0.75%的利多卡因1∶1混合劑行球后麻醉，置開瞼器，固定上、下直肌，用妥布霉素稀釋液充分沖洗結(jié)膜囊，根據(jù)病灶直徑選擇合適的角膜環(huán)鉆制作角膜植床，用手術(shù)刀片逐層剖切病變角膜，至病灶完全清除，選擇與病灶角膜直徑等大的環(huán)鉆制作植片，采用10-0尼龍線將生物工程角膜植片間斷對位縫合于角膜植床，線結(jié)轉(zhuǎn)埋。

1.2.2術(shù)后治療所有患者均在術(shù)后1、3、6、9、12mo進(jìn)行隨訪觀察。參照Holland評分方法，以角膜混濁、水腫、新生血管3項評分之和定義為免疫排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection index，RI)，當(dāng)RI≥6時即認(rèn)為發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，應(yīng)用1%醋酸潑尼松龍滴眼液、0.1%他克莫司滴眼液、0.1%玻璃酸鈉滴眼液點眼，均每日4次，妥布霉素地塞米松眼膏睡前點眼1次，給予靜脈滴注地塞米松10mg并逐漸減量治療。觀察2wk患者病情無緩解，再行同種異體穿透角膜移植手術(shù)，并對生物工程角膜組織進(jìn)行免疫病理檢查。RI≤6患者給予1%醋酸潑尼松龍滴眼液、0.1%他克莫司滴眼液、0.1%玻璃酸鈉滴眼液點眼，均每日3次，角膜植片逐漸透明。

1.2.3激光共焦顯微鏡檢查應(yīng)用HRT3激光共焦顯微鏡(分辨率為1μm，放大倍數(shù)為800倍)對所有生物工程角膜移植術(shù)后出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)患者術(shù)眼及對側(cè)眼進(jìn)行檢查，應(yīng)用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液點眼2次進(jìn)行表面麻醉，囑咐患者下頜放于顯微鏡托架上，保持頭正位，移動手柄，使角膜接觸帽定位在受檢者角膜中央部位，調(diào)節(jié)成像焦點平面，使角膜各層圖像通過計算機屏幕同步顯示，采集各層角膜圖片并保存。利用NAVIS軟件對角膜各層細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，尤其是角膜上皮下朗格罕氏細(xì)胞的活化程度[又名樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)，靜止期形態(tài)為短棒狀，活化期有明顯突起]和基質(zhì)層內(nèi)炎癥細(xì)胞(表現(xiàn)為圓形或橢圓形細(xì)胞，體積較角膜基質(zhì)細(xì)胞略小)密度。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色及HE染色實驗石蠟切片免疫組化染色采用S-P法。以正常羊血清孵育替代一抗孵育，作為陰性對照；以PBS孵育替代一抗孵育，作為空白對照。采用Olympus-BX43光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。試劑：CD4、CD8單克隆抗體(即用型)，即用型免疫組化UltraSensitiveTMplus廣譜試劑盒，抗原修復(fù)液(EDTA法)，正常羊血清，DAB顯色液。以上試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。HE染色步驟如下：脫蠟，脫蠟二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min，事先準(zhǔn)備好蓋玻片；覆水，100%(Ⅰ、Ⅱ)、90%、80%、70%酒精各5min，自來水沖洗5min×3；蘇木精染色5min，流水沖洗；5%乙酸分化1min，流水沖洗，用吸管滴加乙酸，布滿玻片上的組織即可，分化后顏色變淺了一些，成為藍(lán)色；伊紅染色1min，流水沖洗；脫水：70%、80%、90%、100%酒精各10s，二甲苯1min，可以在通風(fēng)櫥自然晾干再封片，約5min；滴上中性樹膠，封片，用吸管滴上一滴即可，盡量少滴，但壓片后要將組織全部覆蓋完，避免中間有氣泡。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。術(shù)眼與對側(cè)眼出現(xiàn)角膜上皮下活化的朗格罕氏細(xì)胞比例的比較采用卡方檢驗。角膜基質(zhì)中炎細(xì)胞密度術(shù)眼與對側(cè)眼比較采用配對樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1納入患者一般資料情況本研究共收集生物工程角膜移植術(shù)后患者180眼，其中發(fā)生免疫排斥反應(yīng)患者5眼，免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率為2.8%。其中男4例，女1例，年齡45～61歲。5眼中細(xì)菌性角膜炎2眼(1眼因角膜異物導(dǎo)致細(xì)菌性角膜炎，1眼為眼部堿燒傷后繼發(fā)細(xì)菌性角膜炎)；真菌性角膜炎3眼。

2.2裂隙燈及激光共焦顯微鏡檢查病例1，男，61歲，術(shù)前BCVA：數(shù)指/40cm，臨床診斷為右眼細(xì)菌性角膜炎，行生物工程角膜板層移植術(shù)，術(shù)后6mo角膜植片高度水腫，可見角膜上皮缺損，鼻側(cè)新生血管長入，RI評分12分；激光共焦顯微鏡檢查顯示上皮下及淺基質(zhì)層存在大量活化的朗格罕氏細(xì)胞(具有短樹突或長樹突的細(xì)胞)，基質(zhì)層可見大量圓形高反光的炎癥細(xì)胞,見圖1。病例2，女，50歲，術(shù)前BCVA：手動/30cm，右眼真菌性角膜炎，角膜移植術(shù)后5mo發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，RI評分10分；激光共焦顯微鏡檢查顯示淺基質(zhì)層活化的朗格罕氏細(xì)胞及炎癥細(xì)胞。病例3，男，45歲，術(shù)前BCVA：數(shù)指/50cm，右眼堿燒傷繼發(fā)細(xì)菌性角膜炎，角膜移植術(shù)后9mo發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，RI評分9分；激光共焦顯微鏡檢查亦可見活化的朗格罕氏細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。病例4，男，56歲，術(shù)前BCVA：手動/20cm，左眼真菌性角膜炎，術(shù)后6mo發(fā)生排斥反應(yīng)，RI評分9分；角膜基質(zhì)層可見朗格罕氏細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。病例5，男，53歲，術(shù)前BCVA：0.1，左眼真菌性角膜炎，術(shù)后7mo發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，RI評分10分；激光共焦顯微鏡可見朗格罕氏細(xì)胞和炎細(xì)胞，見圖2。

圖1 病例1術(shù)眼前節(jié)和激光共焦顯微鏡照片及免疫病理圖片 A～C:眼前節(jié)照片；D、E:激光共焦顯微鏡照片；F:HE染色；G、H:S-P染色。

圖2 病例5術(shù)眼前節(jié)和激光共焦顯微鏡照片及免疫病理圖片 A、B:眼前節(jié)照片；C、D:激光共焦顯微鏡照片；E:HE染色；F、G:S-P染色。

術(shù)眼的RI為9～12(平均10±1.1)分。激光共焦顯微鏡檢查顯示術(shù)眼角膜上皮下可見活化郎格罕氏細(xì)胞，其活化比例74.2%,與對側(cè)眼15.2%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.29，P<0.001)?；|(zhì)層大量炎癥細(xì)胞1641±160/mm2，與對側(cè)眼78±23/mm2比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.5，P<0.05)。

2.3免疫病理檢查結(jié)果病例1在角膜全層HE染色均可見炎癥細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞(圖1F)，在角膜基質(zhì)深層及淺層均可見CD4+細(xì)胞的表達(dá)(圖1G)，同樣可見CD8+細(xì)胞的表達(dá)(圖1H)。病例2、3、4及5的患者HE染色角膜基質(zhì)全層可見炎癥細(xì)胞，未見嗜酸性粒細(xì)胞，在角膜基質(zhì)層可見CD4+細(xì)胞的表達(dá)，亦可見CD8+細(xì)胞的表達(dá)，病例5免疫病理圖片見圖2。

3討論

目前臨床主要應(yīng)用的生物工程角膜是豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)，這是一種基于細(xì)胞組織工程學(xué)的角膜替代材料，在同種異體角膜供體材料缺乏的今天，在一定程度上緩解了角膜供體匱乏的局面，為臨床感染性角膜患者保留了眼球，并恢復(fù)部分患者視力。然而即使是脫細(xì)胞的角膜基質(zhì)降低了移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)[5-7]，我們在臨床應(yīng)用中仍可見免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。本研究收集我院生物工程角膜移植術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)患者作為研究對象，對其進(jìn)行裂隙燈檢查、激光共焦顯微鏡和免疫組織病理研究，以期從臨床體征、活體細(xì)胞觀察、免疫病理等方面深入揭示生物工程角膜移植免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的機制，為臨床治療提供依據(jù)，提高手術(shù)的成功率。

本研究發(fā)現(xiàn)生物工程角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)表現(xiàn)為角膜植片的水腫、混濁、新生血管的長入，早期還存在角膜上皮缺損。如果此時未能得到及時診治，角膜植片的溶解和混濁加重，會嚴(yán)重影響患者術(shù)后視力。同時，角膜植片溶解進(jìn)展的后果是嚴(yán)重的，可能會發(fā)生角膜穿孔等并發(fā)癥。因此，對于行生物工程角膜移植術(shù)的患者需要更加嚴(yán)密的隨訪與觀察。另外，除了術(shù)后糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的應(yīng)用外，術(shù)前對生物工程角膜移植適應(yīng)證的選擇、術(shù)中植床植片的對合良好及術(shù)后及時拆除縫線等對預(yù)防術(shù)后免疫排斥反應(yīng)亦是至關(guān)重要的影響因素。術(shù)前患者角膜潰瘍直徑較大、潰瘍偏位、潰瘍深度達(dá)到角膜厚度的1/2以上、瞼板腺功能障礙及瞼緣炎等均會導(dǎo)致術(shù)后免疫排斥反應(yīng)率增加。根據(jù)生物工程角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)機制的觀察及研究，治療仍以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物治療為主[8]，若進(jìn)行性進(jìn)展，則須再次行同種異體角膜移植手術(shù)。

激光共焦顯微鏡是一種高分辨率、高放大倍數(shù)并且無創(chuàng)的顯微鏡，為我們進(jìn)一步了解生物工程角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時角膜的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化的動態(tài)評估提供了重要的工具[9]。本研究對患眼的共焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，角膜上皮下及基質(zhì)層可見大量活化的朗格罕氏細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，這點與同種異體角膜移植排斥相同[10],推測是由于細(xì)胞免疫在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用，多種細(xì)胞參與其中，如輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等重要的免疫活性細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。同樣在生物工程角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)中，角膜上皮下及基質(zhì)層活化的樹突狀細(xì)胞仍然是重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫的發(fā)生。DCs是目前已知的功能最強的抗原呈遞細(xì)胞，也是活化初始T細(xì)胞最有效的細(xì)胞，未成熟的DCs刺激初始T細(xì)胞活化的能力很弱，但成熟的DCs能有效刺激活化初始T細(xì)胞，對免疫反應(yīng)進(jìn)行啟動、調(diào)控及應(yīng)答[8]。

為進(jìn)一步證實在共焦顯微鏡下炎癥細(xì)胞的性質(zhì)，我們對所有患者再次手術(shù)時取下的生物工程角膜組織進(jìn)行免疫組化和HE染色，研究發(fā)現(xiàn)所有生物工程角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)患者角膜基質(zhì)淺層、深層及全層均有不同程度的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的表達(dá)，由此推斷細(xì)胞免疫參與生物工程角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)，多種細(xì)胞因子介導(dǎo)下的CD4+細(xì)胞引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和CD8+細(xì)胞所致的細(xì)胞毒作用會對移植片造成組織損傷。這與以往文獻(xiàn)報道的生物工程角膜移植動物試驗中結(jié)果一致[11]。另外，在我們的研究中有1眼角膜組織經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)了大量的嗜酸性粒細(xì)胞。嗜酸性粒細(xì)胞是淋巴細(xì)胞活化因子RANTES與IL-16的主要來源，通過上調(diào)黏附分子的表面表達(dá)增強跨內(nèi)皮移動，從而刺激細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而參與免疫反應(yīng)；同時，RANTES與IL-16對淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞有很強的趨化作用，會進(jìn)一步加重組織的炎癥和損傷[12]。在生物工程角膜移植免疫排斥中發(fā)現(xiàn)的大量嗜酸性粒細(xì)胞，可能是因為異種抗原移植而誘發(fā)的超敏反應(yīng)，進(jìn)一步機制有待探索和研究。

生物工程角膜應(yīng)用于板層角膜移植治療感染性角膜炎，不僅可以有效控制感染，提高患者視力，而且其免疫排斥反應(yīng)與同種異體人角膜移植機制類似，但術(shù)后糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物的應(yīng)用對于減少免疫排斥反應(yīng)仍屬必要。生物工程角膜移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)需要從圍手術(shù)期的各環(huán)節(jié)進(jìn)行防控，以保證生物工程角膜植片良好的透明性恢復(fù)角膜視覺功能。生物工程角膜有效緩解了角膜供體來源不足的現(xiàn)狀。