王嘉文，宋璐，張瀟，洪苑浩，袁強(qiáng)華，詹華奎▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

腎病綜合征(Nephrotic Syndrome，NS)是以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥及水腫為表現(xiàn)的一組臨床癥候群，其病理過程為足細(xì)胞損傷、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化，繼之腎小球硬化和腎功能衰竭[1]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，NS蛋白尿的發(fā)生和足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。腎病蛋白(Nephrin)對(duì)維持足細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性具有重要意義，同時(shí)，Nephrin的丟失也是造成蛋白尿產(chǎn)生的關(guān)鍵[2]。糖皮質(zhì)激素對(duì)腎病綜合征的療效確切，然而其毒副作用明顯，甚至部分患者出現(xiàn)激素耐藥或激素抵抗現(xiàn)象[3]。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方在緩解NS蛋白尿方面療效顯著，且無明顯毒副作用，但其作用機(jī)理尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方是否通過調(diào)節(jié)阿霉素腎病大鼠的Nephrin表達(dá)而緩解蛋白尿的發(fā)生，并且觀察阿霉素腎病大鼠腎臟的病理結(jié)構(gòu)改變，探討其可能的機(jī)制，為補(bǔ)腎活血祛風(fēng)法治療NS提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方，由黃芪45 g，熟地黃15 g，山茱萸20 g，丹參30 g，僵蠶20 g，地龍15 g，蟬蛻10 g，全蝎10 g組成。飲片均購(gòu)自四川省中藥材飲片公司。原生藥材和水以質(zhì)量1∶10的比例備置，武火加熱至沸騰后15 min，而后文火熬制60 min，濾出藥液；第二次加水量和原生藥材以質(zhì)量1∶8備置，其余方法同上，熬制結(jié)束后濾出藥渣，2次藥液合并，濃縮藥液至每毫升含1.15 g 生藥。鹽酸多柔比星(阿霉素，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：D807083)，按2 g/L溶于生理鹽水中。醋酸潑尼松片(三才石岐制藥股份有限公司，批號(hào)：H44023869)，按0.4 mg/mL溶于生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030。

1.3 主要試劑

尿液總蛋白檢測(cè)試劑(上海特康科技有限公司，批號(hào)：FT-D234163)；白蛋白檢測(cè)試劑(上海特康科技有限公司，批號(hào)：1604101)；肌酐檢測(cè)試劑(批號(hào)：DZ28)、尿素氮檢測(cè)試劑(批號(hào)：DZ012)、甘油三酯試劑(批號(hào)：DZ001)、膽固醇試劑(批號(hào)：DZ002)均購(gòu)自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司；蘇木素(北京百靈威科技有限公司，AR級(jí)，批號(hào)：LM10N13)；伊紅(東京化成工業(yè)株式會(huì)，批號(hào)：GL01-GMPC)；Nephrin兔多克隆抗體[北京博奧森生物技術(shù)有限公司，1∶100(濃度)，批號(hào)：bs-0465R]；山羊抗兔/鼠工作液(北京中杉金橋生物有限公司，批號(hào)：SP-9001/SP-9002)；Animal Total RNA lsolation Kit(FOREGENE公司，規(guī)格：200次，批號(hào)：RE-03014)；PrimeScript RT reagent Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：100 Preps，批號(hào)：RR047A)。

1.4 主要儀器

全自動(dòng)生化分析儀(上海特康科技公司，型號(hào)：TC6010L)；病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司，型號(hào)：XLCU-PHY-Ⅲ)；三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BA400Digital)；透射電鏡(日立公司，型號(hào)：JEM-1400PLUS)；實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司，型號(hào)：PIKORed 96)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后測(cè)定24 h尿蛋白定量，小于10 mg的標(biāo)記選用，共計(jì)57只，隨機(jī)抽取10只大鼠作為空白對(duì)照組。其余47只大鼠均兩次尾靜脈注射鹽酸多柔比星(阿霉素)，初次用量為4 mg/kg，第8天注射3.5 mg/kg，空白組同法注射等容積生理鹽水。第二次注射鹽酸多柔比星3周后，隨機(jī)從中抽取4只大鼠檢測(cè)其外周血，以24 h尿蛋白定量大于100 mg、白蛋白降低和血脂升高為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。該批次大鼠造模成功，共計(jì)45只，死亡2只。

2.2 動(dòng)物分組及治療

將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、激素組、補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方組、激素+補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方組。空白組不予干預(yù)，模型組以1 mL/100 g等體積蒸餾水灌胃，激素組以醋酸潑尼松片混懸液6 mg/(kg·d)灌胃，補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方組以補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方藥液17.19 g/(kg·d)灌胃,激素+補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方組上午以潑尼松6 mg/(kg·d)灌胃，下午以補(bǔ)腎活血祛風(fēng)方藥液17.19 g/(kg·d)灌胃，各組大鼠每日定時(shí)給藥，連續(xù)給藥4周。

2.3 標(biāo)本采集

各組大鼠分別在干預(yù)4周后檢測(cè)24 h尿蛋白定量。收集24 h尿液后，腹主動(dòng)脈采血；摘取大鼠雙側(cè)腎臟分別置于3%戊二醛固定液中待電鏡檢查和免疫組化染色，于10%中性甲醛溶液中待光鏡檢查和放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)銹CR檢測(cè)。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)項(xiàng)目

2.4.1 一般情況 每周觀察并記錄大鼠體質(zhì)量、毛發(fā)、活動(dòng)情況、水腫狀況、排尿情況、飲水?dāng)z食情況等。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 24 h尿蛋白定量、血脂、腎功能、血清白蛋白等指標(biāo)。

2.4.3 伊紅(HE)染色觀察腎組織病理形態(tài) 將腎組織置于中性甲醛固定后依次脫水、石蠟包埋、切片；于蘇木素和伊紅中染色；梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封固；光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟基本病理變化。

2.4.4 電子顯微鏡檢測(cè) 先后在3%戊二醛和1%四氧化鋨中進(jìn)行組織固定，梯度丙酮逐級(jí)脫水，再用脫水劑和環(huán)氧樹脂(型號(hào)Epon812)進(jìn)行浸透；后包埋以備切片；醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下進(jìn)行腎臟超微病理學(xué)觀察。

2.4.5 免疫組化法檢測(cè)腎組織Nephrin蛋白水平 取腎組織石蠟切片,采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)nephrin蛋白水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定nephrin蛋白的平均積分吸光度。

2.4.6 Real-time PCR 法檢測(cè)腎組織Nephrin mRNA表達(dá) 取新鮮腎組織PCR檢測(cè)，引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo 公司)分析PCR過程各檢測(cè)樣本的CT(Threshold cycle)值。本實(shí)驗(yàn)室通過 2-△△CT計(jì)算 X 相對(duì) mRNA 表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 一般情況

與空白組比較，模型組大鼠皮毛干枯，活動(dòng)下降，尾部不同程度潰爛，攝食量減少，體重增速減慢，腹腔積液，近一半造模大鼠出現(xiàn)不同程度門齒松動(dòng)或斷裂。與模型組對(duì)比，各干預(yù)組大鼠一般情況有所改善，激素組出現(xiàn)明顯狂躁興奮、大量腹腔積液。補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組和激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組大鼠體重增加較潑尼松組輕。

3.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

3.2.1 各組大鼠尿蛋白比較

造模后，各造模組大鼠24 h尿蛋白定量明顯高于空白組(P<0.05)，說明造模成功；干預(yù)4周，與模型組比，各干預(yù)組蛋白尿定量均降低(P<0.05)；與激素組和補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組比較，激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組蛋白尿定量更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；激素組與補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組比，尿蛋白沒有明顯降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量

3.2.2 干預(yù)4周后各組大鼠生化相關(guān)指標(biāo)

各組大鼠血Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比，各組Alb降低(P<0.05)，模型組和補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組BUN降低(P<0.05)，各組TC、TG升高(P<0.05)。與模型組比，激素組TC和TG升高(P<0.05)，其余兩組TC和TG降低(P<0.05)。與激素組比，補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組和激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組TG和TC降低(P<0.05)，且后兩組在降血脂方面無明顯差異(P>0.05)(見表2)。

表2 干預(yù)4周各組大鼠生化指標(biāo)

3.3 各組大鼠腎臟組織Nephrin免疫組化染色結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠腎組織Nephrin蛋白水平明顯降低，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，各組大鼠腎組織Nephrin蛋白水平均無明顯變化，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3，圖1)。

表3 各組大鼠腎組織Nephrin蛋白平均光密度

3.4 PCR檢測(cè)各組大鼠4周末腎組織Nephrin mRNA表達(dá)變化

與空白組相比，各組大鼠腎臟組織中Nephrin mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，各干預(yù)組大鼠腎臟組織中Nephrin mRNA表達(dá)均升高(P<0.05),激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組在升高Nephrin mRNA表達(dá)上最優(yōu)。補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組與激素組比，Nephrin mRNA表達(dá)無明顯升高(P>0.05)(見表4，圖2)。

表4 大鼠腎臟組織Nephrin mRNA表達(dá)

3.5 各組大鼠腎臟病理改變

3.5.1 HE染色腎組織病理光鏡觀察

干預(yù)4周觀察結(jié)果：空白組大鼠腎單位結(jié)構(gòu)正常，無腫大現(xiàn)象，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化改變。模型組可見腎小球腫大，部分毛細(xì)血管基膜略增厚；腎小管上皮細(xì)胞水腫變性部分?jǐn)U張內(nèi)有蛋白樣物質(zhì)沉積；腎間質(zhì)內(nèi)可見纖維組織增生，伴有不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，各干預(yù)治療組腎小管上皮細(xì)胞變性，腎間質(zhì)纖維組織增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等癥狀均有不同的改善(見圖3)。

3.5.2 電鏡觀察

空白組腎小球足細(xì)胞足突形態(tài)正常無融合，基底膜結(jié)構(gòu)清晰，無電子致密物沉積。模型組足突廣泛融合或消失，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞核染色質(zhì)聚集。各干預(yù)組組足細(xì)胞融合減輕，多呈節(jié)段性融合。其中，激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組的足細(xì)胞病變緩解較補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組和激素組佳(見圖4)。

4 討論

NS屬本虛標(biāo)實(shí)之證，虛以脾腎虛損為主，疾病遷延日久，正氣愈虛，易與瘀血、濕熱、風(fēng)邪等毒邪郁結(jié)，故在外可表現(xiàn)為水腫、舌暗、煩熱等實(shí)證[4-5]。尿中蛋白為體內(nèi)水谷精微轉(zhuǎn)化所得，受腎之封藏。當(dāng)外風(fēng)犯肺，子病及母，腎失固攝，而風(fēng)為陽邪，易襲陽位，則精微下注。此外，久病傷腎，腎水不足以制心火，內(nèi)灼陰液，致肝腎陰虛，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，風(fēng)性開泄致精微外泄[6-9]。故以“補(bǔ)腎活血”為基本治法，注重“風(fēng)”邪的危害，以“扶正防風(fēng)，祛風(fēng)透邪”為治療思路。方中黃芪、熟地黃，補(bǔ)益脾肺、填精益髓，主入腎經(jīng)，共同為君藥；山茱萸補(bǔ)益肝腎、固澀滑脫，丹參活血養(yǎng)血而性微寒尤適合瘀血兼夾濕熱之證，二者相和補(bǔ)而不滯，共為臣藥；地龍、全蝎、蟬蛻、僵蠶皆為蟲類藥長(zhǎng)于祛風(fēng)透邪、通絡(luò)散結(jié)，又可入絡(luò)搜風(fēng)，在降蛋白尿方面療效確切[10-13]，又可增強(qiáng)丹參活血化瘀之效，共為佐藥。

阿霉素大鼠腎病模型，經(jīng)證實(shí)類似于人類微小病變性腎病(Minimal Change Disease，MCD)[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模成功后大鼠納差癥狀明顯，導(dǎo)致攝入蛋白不足，可能是BUN和Cr下降的一個(gè)原因，隨著藥物干預(yù)，大鼠食欲好轉(zhuǎn)，出現(xiàn)了BUN和Cr的略微升高。此外，在臨床中Cr的改變?cè)诩膊≡缙诓伙@著，也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，阿霉素腎病大鼠可發(fā)生脂代謝紊亂，使用激素后可加重這一癥狀，激素組出現(xiàn)了明顯血脂紊亂，而補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方可改善血脂紊亂，甚至可逆轉(zhuǎn)激素導(dǎo)致的血脂紊亂。補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方對(duì)阿霉素腎病大鼠活動(dòng)、進(jìn)食等一般情況的效果優(yōu)于激素組，且糾正激素副作用。研究表明，黃芪、熟地黃和山茱萸在降脂調(diào)脂方面療效顯著，可降低血細(xì)胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原水平、血細(xì)胞黏滯度[15-16]。尿蛋白是NS低蛋白血癥發(fā)生的一個(gè)主要原因，本實(shí)驗(yàn)表明，隨著疾病的進(jìn)展，尿蛋白隨之增加，單用激素或單用補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方，可一定程度延緩尿蛋白增加并且兩者的療效無明顯差異，而激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組在短期內(nèi)的療效最優(yōu)。低蛋白血癥會(huì)增加NS患者血栓栓塞和感染風(fēng)險(xiǎn)，方中丹參抑制血小板的聚集,并可延長(zhǎng)凝血時(shí)間,改善患者的高凝狀態(tài)[17]。阿霉素腎病大鼠的光鏡和電鏡病理變化在早期類似MCD，后期腎小球有逐漸向慢性硬化性發(fā)展的趨勢(shì)。我們發(fā)現(xiàn)，光鏡下各干預(yù)組與同期模型組相比腎小管和集合管中蛋白樣物質(zhì)較少，腎間質(zhì)纖維化、小管細(xì)胞腫大、炎細(xì)胞浸潤(rùn)均有緩解。電鏡下模型組足突廣泛融合消失，而各干預(yù)組觀察到足突病變好轉(zhuǎn)，但可見節(jié)段性融合，其中激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組的足細(xì)胞病理緩解最佳。

Nephrin是位于足細(xì)胞裂孔隔膜的跨膜蛋白，對(duì)于維持基底膜的穩(wěn)定性有重要意義[18]。研究表明，NS患者尿Nephrin升高，局灶節(jié)段性腎小球硬化患者尿Nephrin水平更甚[19]。在阿霉素大鼠足細(xì)胞中Nephrin蛋白表達(dá)明顯低于正常大鼠[20]。我們的研究結(jié)果顯示，各干預(yù)組Nephrin蛋白表達(dá)均無明顯差異。因此，我們進(jìn)一步研究腎組織內(nèi)Nephrin mRNA的水平。PCR結(jié)果顯示，各干預(yù)組Nephrin mRNA的升高與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方組的Nephrin mRNA的升高最為顯著，且其24 h尿蛋白結(jié)果與PCR Nephrin mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明Nephrin在維持腎小球毛細(xì)血管壁完整性，防止白蛋白流失有重要意義，也說明激素+補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方的干預(yù)對(duì)Nephrin的表達(dá)有促進(jìn)作用。24 h尿蛋白定量、PCR Nephrin mRNA表達(dá)與腎臟電鏡和光鏡聯(lián)合觀察表明，腎小球結(jié)構(gòu)受損程度與蛋白尿排泄量呈正相關(guān)，與PCR Nephrin mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這可能與藥物干預(yù)后降低Nephrin磷酸化水平有關(guān)。

綜上所述，激素聯(lián)合補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方在治療NS中的療效確切，對(duì)Nephrin表達(dá)有正向調(diào)節(jié)作用，并且補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方對(duì)脂代謝紊亂和激素導(dǎo)致的副作用有緩解作用。此外，單獨(dú)使用激素或補(bǔ)腎活血袪風(fēng)方的療效在短期內(nèi)難分伯仲，可能與實(shí)驗(yàn)周期短有關(guān)，日后我們將盡可能延長(zhǎng)試驗(yàn)周期，以獲得更可觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。