董強(qiáng)，白靜，岳攀，李陽(yáng)，國(guó)錦琳▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 611137)

桑椹(Mori Fructus)為傳統(tǒng)的藥食同源中藥，中國(guó)藥典規(guī)定其來(lái)源為?？浦参锷orusalbaL.的干燥果穗，具有滋陰補(bǔ)血，生津潤(rùn)燥的功效[1]，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)桑椹多糖是其主要活性成分，具有抗氧化、降血糖、保肝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[2-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]桑椹主要產(chǎn)地有四川省攀枝花市(鹽邊)、山東省德州市(夏津)、新疆維吾爾族自治區(qū)吐魯番市、河北省滄州市(泊頭)等，本研究的樣品采集自桑椹主要產(chǎn)地，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取桑椹多糖的工藝，以優(yōu)化后的工藝提取，并測(cè)定不同批次桑椹的多糖含量。

1 材料

1.1 材料與試劑

葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17042603)；苯酚(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2019012301)；濃硫酸(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：191213)。其他試劑均為分析純。

供試桑椹樣品共13個(gè)批次，分別采自安徽，新疆，河北，山東，北京，四川，具體信息見表1。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)錦琳教授鑒定為?？粕僦参锷５墓肷ｉ?Mori Fructus)。所有藥材樣品均經(jīng)產(chǎn)地加工后留樣保存在成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 桑椹樣品信息

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光度計(jì)(SP-756P型，上海光譜儀器有限公司)，隔膜真空泵(GM-1.0A,天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，超聲波清洗器(SB-120DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)，電子天平(ML304T，精度0.1 mg，德國(guó)梅特勒-托利多公司)，高速冷凍離心機(jī)(3-18KS型，美國(guó)Sigma公司)，冷凍干燥機(jī)(Alpha 1-4 LSCplus，德國(guó)Alpha公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

桑椹皆在冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，各批次樣品含水率水平控制一致。凍干后粉碎，精密稱取1.000 g置50 mL離心管中，按照一定料液比加入超純水，在一定的溫度下超聲提取一定的時(shí)間，離心分離上清，殘?jiān)韵嗤瑮l件提取、離心一次，合并上清，將乙醇加入上清中至乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，4℃放置12 h，離心后棄上清，殘留物即為桑椹多糖[7]。

2.2 多糖含量測(cè)定

采用苯酚硫酸法[8]測(cè)定多糖含量。精確稱取105℃干燥恒重后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品4.0 mg，加水溶解并定容至100 mL，制得濃度為40 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于試管中，加水定容至1.0 mL后加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置30 min后于490 nm處測(cè)定吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的多糖含量以葡萄糖當(dāng)量表示，記為每克桑椹干重含葡萄糖毫克數(shù)，多糖得率記為每克桑椹干重含葡萄糖克數(shù)。

2.3 單因素試驗(yàn)

精密稱取桑椹樣品粉末1.000 g置于50 mL離心管，參考文獻(xiàn)[9-11]的方法，按照表2分別對(duì)溫度、料液比及超聲時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對(duì)多糖得率的影響。做3次重復(fù)試驗(yàn)。

表2 桑椹多糖得率單因素設(shè)計(jì)

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹多糖提取工藝

采用響應(yīng)曲面法對(duì)桑椹多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用design-expert 10.0軟件在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、超聲時(shí)間、溫度，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以桑椹多糖提取得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法(RSM)分析3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響?？疾鞐l件如下表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼

2.5 桑椹多糖含量測(cè)定

采用優(yōu)化后的工藝提取6個(gè)產(chǎn)地的13批桑椹樣品，并以“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定各批提取物的多糖含量。采用SPSS 22.0軟件對(duì)6個(gè)產(chǎn)地的桑椹多糖含量進(jìn)行方差分析，比較不同產(chǎn)地桑椹的多糖含量是否有差異。

3 結(jié)果

3.1 單因素分析

3.1.1 提取溫度對(duì)桑椹多糖得率的影響

35℃～80℃范圍內(nèi)，溫度小于65℃時(shí)得率隨溫度升高而增加，溫度為65℃時(shí)得率達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)增大得率略有減小(見圖1)。

圖1 溫度對(duì)桑椹多糖得率的影響

3.1.2 料液比對(duì)桑椹多糖得率的影響

料液比1∶10 g/mL至1∶25 g/mL范圍內(nèi)，比例增大桑椹多糖得率增加，料液比為1∶15 g/mL時(shí)得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大得率略有減小(見圖2)。

圖2 料液比對(duì)桑椹多糖得率的影響

3.1.3 超聲時(shí)間對(duì)桑椹多糖得率的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)桑椹多糖得率的影響見圖3。超聲時(shí)間為20 min時(shí)，桑椹多糖的得率最高。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)桑椹多糖得率的影響

3.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過響應(yīng)曲面法對(duì)料液比、超聲時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

3個(gè)因素對(duì)桑椹多糖提取得率的影響經(jīng)design-expert 10.0軟件分析，回歸擬合后得二次多項(xiàng)回歸模型:Y=12.39+0.66A-0.32B+1.63C+0.9AB+0.92AC-0.72BC-1.27A2-2.02B2-4.36C2，式中，Y代表多糖得率，A、B、C分別代表溫度、時(shí)間、料液比。方差分析見表5。由表5可知，模型的P<0.01，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P>0.05，R2=0.916 0表明模型擬合程度較高，CV為15.77%，表明試驗(yàn)精確度良好，可用該模型對(duì)桑椹多糖提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由回歸模型顯著性分析可知3個(gè)因素的主次順序?yàn)椋毫弦罕?溫度>時(shí)間。兩兩因素對(duì)桑椹多糖得率的交互作用響應(yīng)面圖，見圖4。

圖4 兩因素交互作用對(duì)多糖得率響應(yīng)面圖

表5 回歸模型方差分析

通過軟件分析，提取桑椹多糖的最佳條件為：溫度為69.88℃、時(shí)間為22.14 min、料液比為1∶16.13 g/mL ，在此條件下多糖得率可達(dá)12.69%。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化工藝條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，為便于實(shí)際操作將條件調(diào)整為：溫度為70℃、時(shí)間為22 min、料液比為1∶16 g/mL，在此條件下多糖得率可達(dá)12.45%。結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果一致，建立的最優(yōu)工藝參數(shù)可靠。

3.3 多糖含量測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=7.785X+0.1734，R2=0.999 1，在0.03～0.20 mg/mL線性良好。根據(jù)公式計(jì)算出提取物中多糖含量(以葡萄糖當(dāng)量計(jì))，結(jié)果見表6。

表6 桑椹多糖提取物的多糖含量

對(duì)6個(gè)產(chǎn)地的桑椹多糖含量進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表7。產(chǎn)地間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表7 6個(gè)產(chǎn)地桑椹多糖含量方差分析

4 討論

超聲法是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、強(qiáng)烈空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、攪拌作用等加速藥物成分進(jìn)入溶劑，從而提高提取效率的方法[9]。有研究表明高溫、超聲等因素對(duì)多糖結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用[12-13]，本實(shí)驗(yàn)中隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)、水浴溫度升高，桑椹多糖得率有所下降，可能是超聲、高溫導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞而損失。本研究采用控溫超聲提取的方式，綜合了加熱和超聲提取的方式，相比已報(bào)道的浸提法[11]用時(shí)更少。本研究測(cè)定了6個(gè)產(chǎn)地13個(gè)批次的桑椹樣品，未發(fā)現(xiàn)多糖含量與產(chǎn)地的相關(guān)性。據(jù)楊文宇[14]考證，由于桑椹易于雜交，其栽培品種有上千余個(gè)。據(jù)陳杭君[15]研究桑椹多糖含量與桑椹栽培種、成熟度有顯著相關(guān)。本研究中不同批次桑椹多糖差異可由栽培品種、栽培技術(shù)等差異導(dǎo)致，產(chǎn)地不是影響桑椹多糖含量的主要因素。