王明輝，李永杰，李道宏，牟婧祎

1開封市婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，河南 開封 475000

2河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450003

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究顯示，基因表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些異常表達(dá)的基因可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程，這也是腫瘤靶基因治療研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。生長(zhǎng)抑制因子4（inhibitor of growth family member 4，ING4）是腫瘤生長(zhǎng)抑制因子家族成員，有核定位信號(hào)，可參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。

ING4

在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，具有抵抗細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用，其在卵巢癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達(dá)下調(diào)。ING4 的作用機(jī)制較為復(fù)雜，能通過調(diào)控多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)功能。既往研究顯示，ING4 通過影響WNT 信號(hào)通路參與調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前，臨床對(duì)ING4 在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究首先初步探討ING4 在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)差異，通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)

ING4

的表達(dá)，探討ING4 對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響和調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年7 月至2018 年12 月開封市婦產(chǎn)醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性宮頸癌；②術(shù)前均未行放化療和免疫治療等相關(guān)治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并精神疾病或精神疾病家族史；③合并智力或認(rèn)知功能障礙。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入50 例宮頸癌患者，年齡28～78 歲，中位年齡59 歲；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期11 例。取50 例宮頸癌患者的宮頸癌組織及相應(yīng)癌旁組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa 均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)，宮頸癌細(xì)胞系CaSki 購(gòu)自無錫欣潤(rùn)生物科技有限公司，正常宮頸細(xì)胞系Ect1/E6E7 購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。caspase 3 抗體、β-catenin 抗體均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，ING4 抗體、c-myc 抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，陰性對(duì)照慢病毒和

ING4

過表達(dá)慢病毒由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建。1.2.2 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)宮頸癌組織和細(xì)胞中

ING4

的相對(duì)表達(dá)量 分別取宮頸癌組織、癌旁組織、宮頸癌細(xì)胞 系Hela、SiHa、CaSki 和 正 常 宮 頸 細(xì) 胞 系Ect1/E6E7，采用Trizol 法提取組織和細(xì)胞中的RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的光密度（optical density，OD），OD/OD比值為1.8～2.0。采用cDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取適量的cDNA，以SYBR Green qRT-PCR 進(jìn)行定量PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃反應(yīng)15 s，55 ℃孵育30 s，72 ℃孵育30 s。以

β

-

actin

作為內(nèi)參，采用2法計(jì)算

ING4

mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

β

-

actin

上游引物：5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATCA-3'，下 游 引 物：5'-CGGACTCGTCATACTCCTGCT-3'；

ING4

上游引物：5'-GGACCTGAAGGCTGAAATTGAC-3'，下游引物：5'-GTCACTGAGGGCATCCCATAC-3'。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中ING4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量 利用放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白提取試劑提取宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa、CaSki 和正常宮頸細(xì)胞系Ect1/E6E7 中的總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠采用10%的分離膠及4%的濃縮膠，常規(guī)方法配制。將提取的蛋白樣品進(jìn)行變性（與loading buffer 混合煮沸5 min）處理，上樣孔內(nèi)蛋白樣品量為40 μg，設(shè)置濃縮膠中電壓為80 V，分離膠中電壓為120 V。肉眼觀察染料跑出凝膠底部時(shí)停止電泳。按照1 mA/cm進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜。取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，經(jīng)過5%牛血清白蛋白室溫封閉后，將PVDF 膜轉(zhuǎn)移到一抗稀釋液（NG4 一抗以1∶600 稀釋）中，4 ℃孵育過夜，然后將PVDF膜放置于二抗稀釋液[辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記，以1∶3000 稀釋]中，室溫中孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色，利用Labworks 4.6掃描灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算ING4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染和分組方法 取

ING4

mRNA 和ING4 蛋白相對(duì)表達(dá)量最低的宮頸癌細(xì)胞CaSki 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將宮頸癌細(xì)胞CaSki 接種至24 孔板，以MOI=20 的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h 后換液，培養(yǎng)72 h后觀察熒光表達(dá)情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率﹥90%，分別將轉(zhuǎn)染

ING4

過表達(dá)的慢病毒和穩(wěn)定陰性對(duì)照慢病毒的細(xì)胞作為L(zhǎng)v-ING4 組和Lv-NC 組，將沒有轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.5 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞CaSki，接種至96 孔板，接種28 h 后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，添加100 μl 的CCK8 溶液，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的OD 值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力 取對(duì)照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞CaSki，0.25%的胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）將細(xì)胞沉淀重懸洗滌2 次，最后將細(xì)胞懸浮于500 μl 的結(jié)合緩沖液中，然后依次添加Annexin V-FITC 和PI 染液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot 法 檢 測(cè) 細(xì) 胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞CaSki，按照1.2.3 中Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞caspase 3、β-catenin、cmyc 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，其中caspase 3、β-catenin、c-myc一抗的稀釋倍數(shù)分別為1∶400、1∶600、1∶600。1.2.8 WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 處理對(duì)

ING4

過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

ING4

過表達(dá)的Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞，分別以0、20 mmol/L 的WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 處理培養(yǎng)，分別作為L(zhǎng)v-ING4 組和Lv-ING4+LiCl 組，培養(yǎng)48 h 后，采用上述CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力，Western blot 法測(cè)檢測(cè)各組細(xì)胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同組織和細(xì)胞中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

宮頸癌組織中

ING4

mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為（0.32±0.02），明顯低于癌旁組織的（1.42±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=17.93，

P

﹤0.01）。宮頸癌細(xì)胞Hela、CaSki、SiHa 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7，宮頸癌細(xì)胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于宮頸癌細(xì)胞Hela、SiHa，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）（表1）。

表1 宮頸癌細(xì)胞Hela、CaSki、SiHa 和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

2.2 各組宮頸癌細(xì)胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

取

ING4

mRNA 和ING4 蛋白相對(duì)表達(dá)量最低的宮頸癌細(xì)胞CaSki 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，慢病毒轉(zhuǎn)染后，Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組和Lv-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）；對(duì)照組與Lv-NC組宮頸癌細(xì)胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）。（表2）

表2 各組宮頸癌細(xì)胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

2.3 ING4過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞CaSki增殖和凋亡的影響

慢病毒轉(zhuǎn)染后，Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞CaSki的OD 值明顯低于對(duì)照組和Lv-NC 組，細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和Lv-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）；對(duì)照組與Lv-NC 組宮頸癌細(xì)胞CaSki的OD 值和凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）。（表3、圖1）

表3 ING4過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞CaSki的OD值和凋亡率的影響（±s）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ING4過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞CaSki凋亡的影響

2.4 ING4過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

慢病毒轉(zhuǎn)染后，Lv-ING4 組宮頸癌細(xì)胞CaSki中caspase 3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和Lv-NC 組，β-catenin、c-myc 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組和Lv-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）；對(duì)照組與Lv-NC 組宮頸癌細(xì)胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）。（表4）

表4 ING4 過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞CaSki 中caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（±s）

2.5 WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 處理對(duì)ING4過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞CaSki增殖和凋亡的影響

Lv-ING4+LiCl 組宮頸癌細(xì)胞OD 值明顯高于Lv-ING4 組，凋亡率明顯低于Lv-ING4 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表5、圖2）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)WNT/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl處理對(duì)ING4過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞CaSki凋亡的影響

表5 WNT/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl處理對(duì)ING4過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞CaSki的OD值和凋亡率的影響（±s）

2.6 WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 處理對(duì)ING4 過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞CaSki 中β-catenin、cmyc、caspase 3 蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

Lv-ING4+LiCl 組宮頸癌細(xì)胞caspase 3 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于明顯Lv-ING4 組，β-catenin、c-myc 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于Lv-ING4 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表6）

表6 WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 處理對(duì)ING4 過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞CaSki 中β-catenin、c-myc、caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（±s）

3 討論

ING4 首先在人體垂體組織中發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白質(zhì)的C 末端具有高度保守性和核定位作用，ING4 具有廣泛的生物學(xué)作用，參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過程。研究表明，ING4 可抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，腫瘤組織中ING4 表達(dá)下調(diào)與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)。ING4 在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，具有抑制腫瘤細(xì)胞體外惡性生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果表明，

ING4

在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)

ING4

的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的增殖能力降低，這可能提示，ING4在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。腫瘤細(xì)胞凋亡率降低是腫瘤細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，而細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要細(xì)胞內(nèi)一系列基因通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同誘導(dǎo)。目前，臨床對(duì)細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，caspase 與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，caspase 由多個(gè)蛋白成員組成，這些蛋白成員被激活后可以形成一個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。caspase 3 在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中位于最下游，也是細(xì)胞凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白，正常情況下，caspase 沒有活性，只有被激活后形成caspase 3 才可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，caspase 3 活化也被認(rèn)為是凋亡不可逆的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)

ING4

的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞中caspase 3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高，細(xì)胞凋亡率也升高，提示上調(diào)

ING4

的表達(dá)可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，

ING4

在宮頸癌進(jìn)展中可能扮演抑癌基因的作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了ING4 的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)

ING4

的表達(dá)還可以降低宮頸癌細(xì)胞CaSki 中β-catenin、c-myc 蛋白的相對(duì) 表 達(dá) 量。β-catenin 是 經(jīng) 典WNT/β-catenin 信 號(hào)通路的調(diào)控因子，其表達(dá)水平的高低與WNT/βcatenin 信號(hào)通路的激活水平直接相關(guān)。

c

-

myc

是位于WNT/β-catenin 信號(hào)通路的下游基因，WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活可以促進(jìn)c-myc 蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)

ING4

的表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞CaSki 中WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活。既往研究發(fā)現(xiàn)，WNT/β-catenin 信號(hào)通路在惡性腫瘤中過度激活，其活化水平升高可以促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展，阻斷WNT/β-catenin 信號(hào)通路可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WNT/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)

ING4

對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用，表明上調(diào)

ING4

的表達(dá)可能通過調(diào)控WNT/β-catenin 信號(hào)通路影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。既往研究報(bào)道顯示，ING4 作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路有關(guān)，其可以通過影響WNT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控A549 細(xì)胞的生長(zhǎng)過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ING4 參與宮頸癌進(jìn)展可能與WNT/βcatenin 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，ING4 在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，ING4能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)WNT/β-catenin 信號(hào)激活程度有關(guān)，這為今后進(jìn)一步研究ING4 在宮頸癌進(jìn)展中的作用和具體調(diào)控機(jī)制提供了參考資料。