趙星

摘? ? 要：灰霉病是葡萄的主要病害之一，目前噴施化學(xué)農(nóng)藥的防治方法雖然簡(jiǎn)便快速，但會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，且容易在土壤中殘留，長(zhǎng)期使用會(huì)使灰霉菌產(chǎn)生抗藥性。通過查閱大量資料及前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，醉蝶花的存在可抑制多種土傳病害，本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)葡萄灰霉病也有較好的防治效果，并利用菌絲生長(zhǎng)速率法確定了醉蝶花莖葉粉碎物抑制灰葡萄孢的最佳劑量，以此找到了環(huán)保有效、可替代化學(xué)藥劑的生物熏蒸劑，可在未來實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)并加以推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：葡萄灰霉病;醉蝶花;土傳病害;菌絲生長(zhǎng)速率法;生物熏蒸劑

文章編號(hào)： 1005-2690（2021）14-0025-02? ? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)： S436.631.1? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

葡萄灰霉?。℅rapegraymold）是由灰葡萄孢菌引起，在相對(duì)濕度75%～100%時(shí)可快速生長(zhǎng)，在2～31 ℃下均能對(duì)葡萄新梢、葉片、果梗、花序和果實(shí)產(chǎn)生危害，是一種極具威脅性的真菌性病害[1]。該病為土傳病害，以菌絲體、菌核和分生孢子在病殘組織上越冬，是世界上對(duì)葡萄果實(shí)造成嚴(yán)重影響的病害之一。植株染病后，新梢和葉片會(huì)出現(xiàn)褐色病斑或灰色霉層，花序萎縮，幼果脫落，成果有凹陷病斑，前期在枝梗上出現(xiàn)淡褐色水浸狀病斑，中后期病部腐軟、病斑顏色加深。環(huán)境濕度大時(shí)，病斑上產(chǎn)生灰色霉?fàn)钗铮粗畡t使花序和幼果逐漸失水萎縮、干枯脫落。在葡萄開花期至幼果期發(fā)病，果實(shí)轉(zhuǎn)色期至成熟期危害最重，該時(shí)期主要為害葡萄果穗部分，使果穗軟腐，遇陰雨會(huì)長(zhǎng)出一層灰白色霉層，造成果實(shí)腐爛脫落。該病每年有3次發(fā)病高峰期[2]，農(nóng)戶在種植時(shí)管理不細(xì)致、氮肥使用量大、氣候潮濕等情況都有利于葡萄灰霉病的發(fā)生，嚴(yán)重影響品質(zhì)和賣相，使農(nóng)戶損失慘重。

生物熏蒸技術(shù)是指通過分解植物代謝物產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體來達(dá)到抑菌效果。這種方法在中醫(yī)上較為常見，艾蒿“煙熏”、得克斯消毒劑“煙熏”都是利用類似原理達(dá)到除菌效果。但在目前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，熏蒸技術(shù)的應(yīng)用較為空白。前期資料顯示該項(xiàng)技術(shù)除了能夠有效減少部分土傳病原菌的傳播、降低對(duì)作物的危害、提高作物產(chǎn)量，還可以減少土壤有機(jī)質(zhì)的流失、改善土壤的結(jié)構(gòu)，增加有益微生物的種群數(shù)量含量，保證現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此技術(shù)源于利用含有硫代葡萄糖苷（Gl-

ucosinolates，GSLs）的植物抑制土傳病蟲害[3]，研究表明十字花科蔬菜液泡中含有黑芥子酶[4]，可分解GSLs產(chǎn)生大量的異硫酸氰酯類物質(zhì)[5]，具有廣泛的殺菌除螨、防蟲防病、分泌植保素等功效[6]。資料顯示，十字花科的多種植物中含有GSLs結(jié)構(gòu)，具有很大的生物防治潛能，醉蝶花就是其中一種[7-8]。

因此，應(yīng)進(jìn)一步研究其對(duì)灰霉的抑制作用并明確最佳用量，以求將其制成固定藥劑防止生長(zhǎng)期及儲(chǔ)藏期的葡萄發(fā)生灰霉病，以此來幫助農(nóng)戶減少經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)此方法對(duì)于減少化學(xué)農(nóng)藥造成的土壤殘留問題及病原菌的抗性問題也具有重大意義[9]。

1? ?供試材料與方法

1.1? ?供試材料

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）屬于半知菌類（Fungi imperfecti）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Moniliales）、淡色孢科（Moniliaceae）、葡萄孢屬（Botrytis）[10]，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室提供，經(jīng)過活化和形態(tài)學(xué)鑒定后用于本試驗(yàn)。

醉蝶花莖葉粉碎物，保存于-80 ℃冰箱中，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理研究室提供。

1.2? ?PDA培養(yǎng)基的制作

制作1 L PDA培養(yǎng)基，需要稱取去皮馬鈴薯200 g，切成1 cm3的小正方體后放于鍋中，加入1 L蒸餾水，熬煮約10 min后?；疬^濾，定容到1 L后倒入鍋中繼續(xù)熬煮，同時(shí)緩慢加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，待其全部溶解后倒出、分裝滅菌。

1.3? ?灰霉菌的活化與形態(tài)學(xué)鑒定

將滅菌錐形瓶中的PDA加熱融化，稍冷卻后加入2～3滴青霉素以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。在超凈工作臺(tái)中將其趁熱倒入5個(gè)滅菌的平板中備用。

取出實(shí)驗(yàn)室冰箱中保存的灰霉菌進(jìn)行活化。在超凈臺(tái)中打開皿蓋，用直徑為0.90 cm的打孔器在菌落邊緣同一圈上打孔，用移菌勾挑取菌餅，倒置接種在已倒好的凝固的培養(yǎng)基上，貼上封口膜后倒置培養(yǎng)5 d。

選擇灰霉菌長(zhǎng)勢(shì)較好且無雜菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿，挑取其中的菌落進(jìn)行形態(tài)鑒定。在載玻片上滴一滴水，用移菌勾挑取少量菌絲后在水中涂抹，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察。

視野中的菌分生孢子梗叢生，頂端膨大或是尖削，在其上有小的突起;分生孢子單生于小突起之上;分生孢子亞球形或卵形[11]。經(jīng)過鑒定該菌確為灰葡萄孢后將其保存好備用。

2? ?試驗(yàn)方法

2.1? ?供試真菌接種

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定醉蝶花對(duì)葡萄灰霉病菌絲的抑制效果。取出-80 ℃冷凍保存的醉蝶花粉碎葉片備用，將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的葡萄灰霉病病菌，用直徑為0.9 cm的打孔器在同一半徑的菌落邊緣打孔并挑取菌餅，用移菌鉤將菌餅接種于倒有PDA的9.0 cm培養(yǎng)皿中央備用[12]。

2.2? ?莖葉粉碎物對(duì)灰霉抑菌活性的測(cè)定

分別稱量醉蝶花莖葉粉碎物0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g各3份，分別快速倒入接好菌的培養(yǎng)皿皿蓋上，用封口膜封好后在20 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況，并記錄數(shù)據(jù)[13]。

2.3? ?結(jié)果調(diào)查與統(tǒng)計(jì)分析

每處理3次重復(fù)，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑，取其平均值。根據(jù)測(cè)得的結(jié)果，計(jì)算醉蝶花提取液對(duì)葡萄灰霉病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。

3? ?結(jié)論與分析

3.1? ?試驗(yàn)結(jié)論

本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了醉蝶花莖葉粉碎物對(duì)葡萄灰霉病病菌的抑制作用，并通過試驗(yàn)確定了粉碎物發(fā)揮抑菌作用的最適劑量。結(jié)果表明，0.2 g/皿、0.4 g/皿 0.6 g/皿、0.8 g/皿、1.0 g/皿都有一定的抑菌效果，其中1.0 g/皿和0.8 g/皿的效果較好，0.8 g/皿左右的濃度抑菌效果最好。試驗(yàn)培養(yǎng)情況及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1、表1。

3.2? ?討論

回顧整個(gè)試驗(yàn)過程，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)存在以下一些問題，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

（1）醉蝶花莖葉粉碎物這一材料是取自-80 ℃的冰箱中，取出時(shí)粉碎物上含有細(xì)小冰晶且無法分離，故稱量時(shí)的質(zhì)量包含一定冰的質(zhì)量，而不是粉碎物的凈重，造成所稱量的粉碎物偏少，小于應(yīng)該稱量的理論值。

（2）在稱量過程中，粉碎物表面的冰會(huì)融化成水，使粉碎物粘連在稱量紙上，導(dǎo)致向培養(yǎng)基中倒入粉碎物這一過程速度減緩，且無法一次性快速全部倒出。這就導(dǎo)致了兩個(gè)問題，一個(gè)是會(huì)損失一部分粉碎物，使實(shí)際上發(fā)揮熏蒸作用的量比所需的理論值小;另一方面就是打開皿蓋較長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致雜菌進(jìn)入，造成污染。

另外，下一階段本試驗(yàn)還需要從以下幾方面繼續(xù)深入探究。

（1）在試驗(yàn)后期發(fā)現(xiàn)，醉蝶花莖葉粉碎物發(fā)黃變質(zhì)，這證明莖葉粉碎物常溫下無法保存太久，無法持續(xù)發(fā)揮藥效，因此需要提取有效物質(zhì)用于生產(chǎn)實(shí)踐，而不是直接使用莖葉粉碎物。

（2）雖然確定了醉蝶花本身具有抑菌作用，但究竟是哪些物質(zhì)起到了抑菌作用目前尚不明確。因此需要進(jìn)一步分析其有效成分，并探究各有效成分的最適濃度。希望在明確有效成分后直接人工合成該物質(zhì)，制成藥劑在實(shí)踐中防治葡萄灰霉病。

4? ?結(jié)束語

葡萄灰霉病作為影響葡萄產(chǎn)量和品相的重要病害，目前的防治方法除了化學(xué)藥劑防治外還有選用抗病品種、加強(qiáng)栽培管理措施、施用化學(xué)藥劑以及物理防治方法，但這些方法都有各自的缺點(diǎn)：選用抗病品種，不同的葡萄品種間對(duì)灰霉病的抗性差異顯著，病害可能發(fā)生突變，對(duì)原來具有抗性的植株不敏感，可以繼續(xù)危害，導(dǎo)致抗病品種的抗性消失;通過加強(qiáng)水肥管理在整枝定穗初期進(jìn)行防治，通過間種、套作、輪作等方式，減少病原寄主，效果良好，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，但工作繁重冗雜，處理起來較為困難;大棚等種植場(chǎng)所、修剪種植工具應(yīng)及時(shí)消毒，減少菌源，通過高溫悶棚為苗床消毒，但此方法只能作為輔助，并不能真的防治病害。

隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，社會(huì)對(duì)于更加綠色安全的生物防治關(guān)注度也越來越高。化學(xué)農(nóng)藥雖然見效快，但其造成的環(huán)境污染也日漸顯現(xiàn)。病原菌開始出現(xiàn)抗病性，這使得農(nóng)民們不得不加大劑量或者不斷更換藥劑，造成更進(jìn)一步的污染和抗性增加，甚至出現(xiàn)交互抗性。因此生物農(nóng)藥的發(fā)明推廣迫在眉睫，而熏蒸技術(shù)作為更加高效的防治方法，發(fā)展前景廣闊[14]。用醉蝶花揮發(fā)物質(zhì)防治土傳病害，這一研究領(lǐng)域目前仍為空白，在發(fā)現(xiàn)其抑菌效果后，會(huì)以此為切入點(diǎn)，深入研究其對(duì)其他土傳病害的防治作用[15]。

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