劉杰，劉剛*,李姝潔，鄧子昂，歐全宏，時有明

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500;2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011)

1 引言

種子老化是種子活力在生理成熟期達到最高后開始出現(xiàn)不可逆的自然衰退，這是種子貯藏過程普遍存在的一種現(xiàn)象[1]。種子老化過程中會伴隨組織結(jié)構(gòu)松弛，生理代謝紊亂，酶活性降低，膜質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)降解，有毒物質(zhì)積累等生理生化的變化[2]。種子老化影響田間出苗率，糧食老化影響食用品質(zhì)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響。自然老化往往歷時較長，人工加速老化因縮短自然老化種子所需時間而被廣泛應(yīng)用[3]。

自然老化是指種子在自然儲藏或種質(zhì)庫保存的條件下，其發(fā)芽力會逐漸喪失的一種自然現(xiàn)象[3]。人工加速老化是指人工創(chuàng)造利于種子老化條件，加速種子劣變的處理過程，包括高溫高濕加速老化、熱水浴加速老化、50%甲醇老化法等[4]。隨著對人工老化和自然老化種子的深入研究，人工老化取代自然老化研究老化種子的趨勢越發(fā)明顯。董國軍等[3]研究水稻種子在人工老化和自然老化條件下的變化，表明人工老化可替代自然老化對水稻耐貯藏種植的篩選和育種改良。胡國玉等[5]比較人工老化和自然老化大豆種子的結(jié)果，表明在一定的人工老化條件下可以有效鑒定大豆種子抗老化性。Kamizake等[6]研究了人工老化和自然老化對大豆物理特性的影響，兩種老化結(jié)果趨于一致。高華偉等[7]以21份大豆種質(zhì)在人工老化和自然老化的結(jié)果進行比較，表明大部分種質(zhì)在人工老化處理下能較好地反映自然老化的過程。Zaheer等[8]利用dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法和6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法研究自然老化和人工老化小麥種子的盾片和糊粉層的形態(tài)和分子變化，對種子貯藏過程中的種子活力進行檢測。Zhang等[9]采用自然老化和人工老化對246株系的大豆種子處理，篩選出12個具有良好耐貯性的品系，用于育種工作。高琴梅等[10]認為大豆種子在人工老化和自然老化的老化機制是一致的，丙二醛(MDA)和4-羥基壬烯醛(4-HNE)的含量變化可能存在一定差異。

FT-IR是一種快速無損的技術(shù)[11]，二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜用來提高光譜的分辨率[12]，二維相關(guān)紅外光譜是利用溫度擾動對基團分子的振動行為進行分析[13]。紅外光譜技術(shù)可以定性和定量的對樣品進行分析，具有成本低、高效、無損、適用樣品范圍廣的特點，已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全等方面[14]。Zhao等[15]利用FTIR光譜的二階導(dǎo)數(shù)分析大豆蛋白中7S和11S球蛋白的二級結(jié)構(gòu)，估算出不同結(jié)構(gòu)的7S和11S球蛋白的相對數(shù)量。Wang等[16]利用傅里葉變換紅外光譜法研究大豆分離蛋白中二級結(jié)構(gòu)與表面疏水性之間的關(guān)系，表明表面疏水性隨著α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲的變化而改變。楊衛(wèi)梅等[14]以自然老化豆類種子為材料，利用紅外光譜三級鑒別法區(qū)分豆類種子的老化程度。G?nül等[17]利用衰減全反射-中紅外光譜法結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析對冷榨葡萄籽油與精致大豆油的混合物進行定量分析和分類。Yasar等[18]采用FTIR光譜化學(xué)計量方法首次用于監(jiān)測豆粕真菌發(fā)酵過程中的化學(xué)和分子結(jié)構(gòu)變化。

本文利用紅外光譜法對自然老化和人工老化的大豆種子進行研究，對老化大豆種子進行區(qū)分，探索老化過程大豆種子的光譜規(guī)律，分析兩種老化條件下大豆種子的老化機理，為大豆種子老化研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 儀器和參數(shù)

紅外光譜儀為美國Perkins Elmer公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換換紅外光譜儀，配備DTGS探測器，測定范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)16，分辨率為4 cm-1。EUROTHERM公司生產(chǎn)的SYD-TC-01型溫度控制儀，溫度范圍為50～120℃每隔10℃采集一次光譜。

2.2 樣品制備

人工老化大豆樣品來自遼寧開源。將大豆樣品放入LH-150S種子老化箱(溫度41℃，相對濕度為95%)進行人工加速老化處理。分別對大豆種子處理2d、6d、10d。未經(jīng)過老化處理的種子作為對照組。

自然老化大豆采自云南陸良縣，在收獲當(dāng)年在室溫下貯藏。分別在貯藏當(dāng)年、貯藏一年、貯藏三年、貯藏五年時對大豆樣品收集并進行測量。

2.3 數(shù)據(jù)處理

將老化大豆樣品研磨為細粉，在瑪瑙研缽中將溴化鉀研磨成細粉，將大豆粉和溴化鉀粉末以一定的比例混合，研磨均勻后進行壓片測量，扣除溴化鉀背景。光譜采集使用Spectum 10軟件，再使用Omnic 8.2紅外光譜處理軟件在原始IR光譜進行13點平滑后獲得的SD-IR光譜。通過使用由清華大學(xué)化學(xué)系編程的2D-IR相關(guān)分析軟件，對在50～120℃每隔10℃采集得到的動態(tài)光譜進行處理，得到2D-IR光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 老化大豆種子的傅里葉變換紅外光譜

圖1是在自然老化和人工老化條件下大豆種子的傅里葉變換紅外光譜。圖中顯示人工老化大豆種子的原始光譜整體相似，自然老化大豆種子的原始光譜整體也相似；兩種老化大豆種子的原始光譜整體相似，但在吸收峰強度上表現(xiàn)出明顯差異。表1是人工老化和自然老化條件下大豆種子的典型特征峰。由表可知，人工老化條件下大豆種子光譜中吸收峰數(shù)目和位置相同，自然老化條件下大豆種子光譜中吸收峰的數(shù)目和位置整體相同，自然老化的大豆種子在1457 cm-1附近的吸收峰表現(xiàn)不明顯，貯藏三年的大豆種子在1745cm-1附近的吸收峰表現(xiàn)較弱。

圖1 人工老化和自然老化大豆種子的傅里葉變換紅外光譜Fig.1 Fourier transform infrared spectroscopy of artificial aging and natural aging soybean seeds

表1 人工老化和自然老化條件下大豆種子典型特征吸收峰Table 1 Typical characteristic absorption peaks of soybean seeds under artificial and natural aging conditions

3.2 老化大豆種子的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜

自然老化和人工老化大豆種子的原始光譜差異不明顯，吸收峰強度差異表現(xiàn)明顯。利用二階導(dǎo)數(shù)對老化大豆種子樣品進行二階導(dǎo)數(shù)處理，進一步分析兩種老化大豆種子光譜的變化。

圖2.1和圖2.2為自然老化條件下和人工老化大豆種子在1800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜。在圖2.1中自然老化大豆種子在1747 cm-1附近的吸收峰強度隨貯藏時間呈現(xiàn)增強趨勢，在貯藏三年出現(xiàn)減弱現(xiàn)象；1693 cm-1在隨著貯藏時間呈現(xiàn)增加的趨勢；在1660，1548，1237 cm-1附近的吸收峰強度隨貯藏時間的增加呈現(xiàn)減弱趨勢，在貯藏五年出現(xiàn)增強；1610～1550 cm-1附近的峰在隨著貯藏時間的呈現(xiàn)增加的趨勢，在貯藏三年出現(xiàn)一定的減弱；在1498 cm-1附近的吸收峰強度呈現(xiàn)增長趨勢；在1402，1053 cm-1附近的吸收峰強度呈現(xiàn)減弱的趨勢；在1150-1000 cm-1范圍內(nèi)吸收峰強度呈現(xiàn)減弱趨勢，但都出現(xiàn)一定增強現(xiàn)象。

圖2.1 自然老化大豆種子在1800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜Fig.2.1 The SD-IR of natural aging soybean seeds in the range of 1800-800 cm-1

圖2.2中人工老化大豆種子在1747 cm-1附近的吸收峰強度隨著老化時間的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢；1691 cm-1附近的峰呈現(xiàn)先減弱再增強的趨勢；在1658，1543，1237 cm-1附近的吸收峰強度隨著時間的增加呈現(xiàn)減弱的趨勢；1610-1550 cm-1附近的峰強度隨老化時間呈現(xiàn)增加的趨勢，在老化2d出現(xiàn)一定減弱；在1415，946，889 cm-1附近的吸收峰強度隨著時間的增加呈現(xiàn)增強的趨勢；在1516，1398，1382，918 cm-1附近的吸收峰強度隨著時間的增加呈現(xiàn)減弱趨勢；1200-1100 cm-1范圍內(nèi)吸收峰強度呈現(xiàn)減弱趨勢，但都出現(xiàn)一定增強。

圖2.2 人工老化大豆種子在1800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜Fig.2.2 The SD-IR of artificial aging soybean seeds in the range of 1800-800 cm-1

綜上所述，1691 cm-1附近的峰為醛/酮類物質(zhì)的典型吸收峰。1610～1550 cm-1附近的峰歸屬為氨基酸的典型吸收峰。兩種老化大豆種子在1747 cm-1附近的吸收峰強度隨著老化程度的增加而增強的趨勢，表明大豆種子中的脂類物質(zhì)在隨著老化程度的增加而增加；在1693 cm-1附近的吸收峰呈現(xiàn)增加趨勢，表明老化的大豆種子中酮/醛類物質(zhì)在增加；與高琴梅[10]測量大豆種子老化中醛類變化的結(jié)果相一致。兩種老化大豆種子在1150-1100 cm-1附近的吸收峰強度呈現(xiàn)減弱趨勢，但隨著老化程度的增加均出現(xiàn)一定的增強現(xiàn)象；表明大豆種子中的糖類物質(zhì)在隨著老化程度呈現(xiàn)減少趨勢，但隨著老化的增加出現(xiàn)一定的增強。在1660，1549，1236 cm-1附近吸收峰強度整體表現(xiàn)出減弱的趨勢，表明大豆種子中蛋白質(zhì)的含量隨著老化程度的增加呈現(xiàn)減少趨勢；在1610-1550 cm-1附近的吸收峰在增加，表明氨基酸含量呈現(xiàn)增加趨勢；這與張自陽等[20]測量老化種子中蛋白質(zhì)隨著老化程度的增加會發(fā)生水解產(chǎn)生游離的氨基酸，并導(dǎo)致可溶性糖的含量出現(xiàn)一定上升的結(jié)果相一致。由二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜對兩種老化大豆種子分析可知，兩種的老化過程中大豆種子的脂質(zhì)物質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的變化趨勢基本一致。

3.3 大豆種子老化的二維相關(guān)紅外光譜

2D-IR可以提高光譜分辨率，提供更多的動態(tài)結(jié)構(gòu)信息[12]。對兩種老化的大豆種子進行二維相關(guān)紅外光譜處理，進一步探索兩種老化大豆種子光譜的變化。

3.3.1老化大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

圖3.1是自然老化條件下大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。貯藏當(dāng)年大豆種子在977，1020，1080，1134，1219 cm-1附近為強自動峰。貯藏一年的大豆種子與貯藏當(dāng)年相比，在890，970，1134，1220 cm-1附近仍為強自動峰，在940，1010，1100，1200 cm-1附近的自動峰強度增強，貯存當(dāng)年最強自動峰出現(xiàn)在1219 cm-1附近，貯存一年出現(xiàn)在1200和1220 cm-1附近。貯存三年與貯存一年相比，在890，940，1200 cm-1附近的自動峰強度逐漸減弱，貯存三年的最強峰出現(xiàn)在1147和1220 cm-1附近。貯藏五年與貯藏三年相比，在904 cm-1附近自動峰強度增強，貯存五年最強峰出現(xiàn)在1219 cm-1附近。

圖3.1 自然老化大豆種子在850-1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：貯藏當(dāng)年；b：貯藏一年；c：貯藏三年；d：貯藏五年Fig.3.1 2D-IR of natural aging soybean seeds in the range of 850-1250 cm-1.a:Harvest year;b:Storage for one year;c:Storage for three year;d:Storage for five year

圖3.2是人工老化條件下大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。大豆種子老化過程中在898，960，1020，1068，1110，1129，1214 cm-1附近均出現(xiàn)了自動峰；最強自動峰均出現(xiàn)在1214 cm-1附近，自動峰強度隨著老化時間的逐漸減弱。未老化大豆種子在898 cm-1附近的峰強高于960 cm-1附近，在老化10d處正相反，在老化2d和6d處自動峰強度基本相同。未老化和老化2d大豆種子在1008 cm-1附近出現(xiàn)一個弱自動峰。老化的大豆種子在1165 cm-1處均出現(xiàn)一個中強峰。未老化大豆種子在1088 cm-1處附近出現(xiàn)一個自動峰。

圖3.2 人工老化大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：未老化；b：人工老化2d；c：人工老化6d；d：人工老化10 dFig.3.2 2D-IR of artificial aging soybean seeds in the range of 850-1250 cm-1.a:Unaged soybean seeds;b:Aging for 2 days;c:Aging for 6 days;d:Aging for 10 days

3.3.2老化大豆種子在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

圖3.3是自然老化條件下大豆種子在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。大豆種子在貯藏過程中在1458，1556，1629，1752 cm-1附近均出現(xiàn)自動峰。貯存當(dāng)年均為強自動峰，貯存一年在1553，1649cm-1附近為強自峰，貯存三年在1553，1565，1631，1752 cm-1附近為強自峰，貯藏五年在1558和1631 cm-1附近為強自動峰。

圖3.3 自然老化條件下大豆種子在1450-1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：貯藏當(dāng)年；b：貯藏一年；c：貯藏三年；d：貯藏五年Fig.3.3 2D-IR of natural aging soybean seeds in the range of 1450-1800 cm-1.a:Harvest year;b:Storage for one year;c:Storage for three year;d:Storage for five year

圖3.4是人工老化條件下大豆種子在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。大豆種子在人工老化過程中均在1491，1556，1621，1743，1759 cm-1附近出現(xiàn)強自動峰。未老化大豆種子在1702 cm-1附近出現(xiàn)一個強自動峰；老化后大豆種子均在1458，1686 cm-1附近表現(xiàn)為一個弱自動峰，在1703 cm-1附近表現(xiàn)為弱自動峰；老化6d大豆種子在1792 cm-1附近出現(xiàn)一個弱自動峰。

圖3.4 人工老化大豆種子在1450-1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：未老化；b：人工老化2d；c：人工老化6d；d：人工老化10dFig.3.4 2D-IR of artificial aging soybean seeds in the range of 1450-1800 cm-1.a:Unaged soybean seeds;b:Aging for 2 days;c:Aging for 6 days;d:Aging for 10 days

在二維相關(guān)紅外光譜中，老化大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)，自然老化條件下貯藏當(dāng)年大豆種子和人工老化條件下未老化大豆種子的自動峰數(shù)目和位置表現(xiàn)一致，兩種老化的大豆種子在1214 cm-1附近的自動峰均為最強峰，均在899，971，1020，1068，1219 cm-1附近表現(xiàn)為強自動峰。在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)，自然老化條件下貯藏當(dāng)年大豆種子和人工老化條件下未老化大豆種子的自動峰數(shù)目和位置表現(xiàn)一致。兩種老化大豆種子均在1458，1556，1621，1759 cm-1附近表現(xiàn)為強自動峰。

二維相關(guān)紅外光譜可以簡化復(fù)雜光譜的重疊峰，提供更多FTIR光譜及其二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜無法獲得的細節(jié)信息。由二維相關(guān)紅外光譜可知，在1165 cm-1附近的峰歸屬為脂質(zhì)，在1200 cm-1附近的峰歸屬于酚類物質(zhì)，1610-1550 cm-1范圍內(nèi)的峰歸屬于氨基酸，1621 cm-1附近的峰為芳香環(huán)中C=O的彎曲振動，1711cm-1附近的峰歸屬于脂肪酸，1100 cm-1附近的峰歸屬為醇類物質(zhì)。表明大豆種子在老化過程中，伴隨著脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)及酚類物質(zhì)等的變化。

綜上所述，利用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜對老化大豆種子進行分析表明，在大豆種子老化過程中脂類物質(zhì)在增加，酮/醛類物質(zhì)在增加；脂肪水解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，同時脂肪氧化產(chǎn)生酮、醛、酸類等物質(zhì)。老化大豆種子中蛋白質(zhì)含量下降，氨基酸含量升高，可能為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生了游離氨基酸。大豆種子在老化過程中的細胞呼吸作用導(dǎo)致糖類物質(zhì)減少，同時在老化過程中醇類物質(zhì)、酚類物質(zhì)發(fā)生變化。

3 結(jié)論

本文采用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜法研究自然老化條件和人工老化條件下的大豆種子。結(jié)果表明，在原始光譜中，人工老化大豆種子的原始光譜整體相似，自然老化大豆種子的原始光譜整體也相似；兩種老化大豆種子的原始光譜整體相似，但在吸收峰強度上表現(xiàn)出了差異。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析顯示，兩種老化的大豆種子中物質(zhì)變化趨勢趨于一致；脂類物質(zhì)增加，蛋白質(zhì)物質(zhì)呈現(xiàn)減少的趨勢，糖類物質(zhì)呈現(xiàn)減少的趨勢，酮/醛類物質(zhì)呈現(xiàn)增加趨勢，氨基酸呈現(xiàn)增加趨勢。人工老化對種子物質(zhì)代謝的影響程度比自然老化的小。在二維相關(guān)紅外光譜中，未老化大豆種子和貯藏當(dāng)年的大豆種子自動峰數(shù)目和位置基本相同；自然老化后的大豆種子與貯存當(dāng)年的大豆種子相比，自動峰強度、數(shù)目和位置發(fā)生明顯變換；人工老化的大豆種子與未老化的大豆種子相比，自動峰數(shù)目和位置基本相同，自動峰的強度發(fā)生改變。利用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜法對自然老化條件下和人工老化大豆種子的分析結(jié)果表明，紅外光譜法可以實現(xiàn)快速、方便的對兩種老化大豆種子的光譜變化進行研究。